郎小乔 孙勇虎 付希安 孙乐乐 刘 红 张福仁

I型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1， OMIM：162200)又称Von Recklinghausen病，是一种常见的常染色体显性遗传病，其特征表现为皮肤牛奶咖啡斑、神经纤维瘤、腋窝或腹股沟雀斑、Lisch结节、骨骼异常、学习障碍等。发病率约为1/3500[1]，其中约50%是自发突变，成人外显率接近100%。本研究对3例散发患者进行基因检测，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 病例1，女，17岁。7岁时颈部出现咖啡斑，逐渐增大增多，并向躯干、四肢蔓延。17岁时躯干和上肢部位开始出现多个凸起皮肤表面的肿物。皮肤科检查：全身遍布大小不一的咖啡斑、神经纤维瘤，有腋窝、腹股沟雀斑(图1a、b)。患者弟弟、妹妹、父母均正常，否认家族史。病例2，男，44岁。14岁时躯干开始出现咖啡斑和突起皮肤表面的肿物，数量逐渐增多。皮肤科检查：全身遍布米粒大咖啡斑和大小不一的神经纤维瘤(图1c、d)。患者儿子、父母均正常，否认家族史。病例3，女，20岁。自出生起躯干部位发现多个咖啡斑，后逐渐增大增多。20岁时右大腿根处出现凸起皮肤表面的肿物。皮肤科检查：全身遍布大小不一的咖啡斑，有腋窝、腹股沟雀斑，躯干散在分布米粒大神经纤维瘤，右侧腹股沟区有1 cm×2 cm大神经纤维瘤(图1e、f)。患者父母均正常，否认家族史。3例患者均在外院行眼科检查，未发现Lisch结节。本研究经过山东省皮肤病与性病防治研究所伦理委员会批准，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 外周血DNA提取 分别抽取3例患者及其5位家属5 mL外周血，放置于5 mL EDTA抗凝管中，在-80℃保存。使用TGuide Large Volume Blood Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA，质控浓度为50 ng/μL,体积为80 μL，A260/A280比值在1.8～2.0之间。同时提取100名无NF1家族史的正常人外周血DNA作为对照组，质控标准同上。

1.3 引物设计与PCR扩增和测序 选用NF1基因cDNA参考序列(NM 001042492)作为转录本，利用网页软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对NF1基因的58个外显子设计特异性引物。进行常规PCR扩增，扩增产物经过纯化后在ABI 3500 xL Dx Genetic Analyzer测序仪(美国ABI公司)上进行测序。测序结果使用Chromas 2.22软件进行分析，并与上述所使用的转录本序列进行比对。

2 结果

病例1，第39号外显子发生碱基G缺失(c.5635delG，图2a)，造成移码突变，致使转录提前终止(p.Cys1878Leufs*1)。病例2，第47号外显子大片段缺失(c.7041～7062+4del,图2b)，造成截断蛋白产生。病例3，第21号外显子发生碱基A、C缺失(c.2714-2715delAC，图2c)，造成移码突变，致使转录提前终止(p.Asp905Thrfs*1)。上述突变在HGMD数据库(http://www.hgmd.org)及近5年发表的NF1相关文献中均未发现相同报道。在3例患者家属及100名正常对照中均未发现上述突变。

a、b：病例1躯干部布满咖啡斑、凸起皮肤表面的神经纤维瘤；c、d：病例2躯干部大量的咖啡斑、神经纤维瘤；e、f：病例3腋窝雀斑和腹股沟1 cm×2 cm大的神经纤维瘤

图1 患者临床图片

a：病例1第39号外显子发生碱基G缺失(c.5635delG，p.Cys1878Leufs*1)；b：病例2第47号外显子大片段缺失(c.7041～7062+4del)；c：病例3第21号外显子发生碱基A、C缺失(c.2714-2715delAC，p.Asp905Thrfs*1)；d、e、f：正常对照序列

图2 患者突变检测结果

3 讨论

现采用的诊断标准为美国国立卫生研究院(NIH)在1988年制定，包括：(1)6个或以上的牛奶咖啡斑， 青春期前直径大于5mm，青春期后直径大于15mm。(2)2个及以上任何类型的神经纤维瘤，或1个丛状神经纤维瘤。(3)腋窝或腹股沟雀斑。(4)视神经胶质瘤。(5)2个及以上虹膜错构瘤(Lisch结节)。(6)骨损害，如蝶骨翼发育不良，长骨皮质细线化，有或无假关节。(7)一级亲属关系中有符合上述标准的NF1。以上标准符合2条即可确诊NF1。

神经纤维瘤蛋白1(neurofibromin 1，NFl)基因突变已被充分证明可引起NF1[2]。NF1基因位于17q11.2，是最大的基因之一，长度为350kb，包括至少60个外显子。高度保守的GAP关联结构域(GRD)是NF1上的一个重要功能区域，已被证实由20～27a号外显子编码[3，4]。该基因编码包含2818个氨基酸的神经纤维瘤蛋白，此蛋白为原癌基因Ras的负性调控因子，有抑制肿瘤的作用。NF1基因体积庞大，测序难度增大，一项基于109例中国NF1患者研究的突变检出率为89%[5]。因此诊断一般依靠NIH临床诊断标准，而不常规采用基因检测的方法，但对于不符合NIH临床诊断标准的疑似患者，以及有遗传咨询、产前诊断等需求的患者，进行NFI基因突变检测是有必要的。到2018年2月为止，人类基因突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)已有超过2700种不同的NF1基因突变记录在内，类型包括错义突变、剪切位点突变以及插入或缺失导致的框移突变等。其中55%的类型为碱基插入、缺失导致的突变，28%的类型为错义突变，16%的类型为剪切位点突变。本研究3例新发突变均为碱基缺失造成截断蛋白的产生，推测由此影响了蛋白正常功能，导致疾病的发生。

NF1基因具有高度可变性表达，家族内或不同家族之间都具有显著表达差异。Sabbagh等[6]通过对来自275个家庭的750例NFl患者的研究发现，临床表现的相似度随血缘关系越远而降低。即使同一个家庭具有相同突变的不同成员之间，临床表现也可存有差异。有研究团队对8对有不同NFl症状的同卵双生子进行研究，发现同卵双生子之间NF1基因启动子存在明显差异，这可能是导致表现型不同的原因[7]。目前已确定的基因型-表现型关系有3种：(1)框内3 bp大小的碱基缺失(c．2970-2972 delAAT)与临床上无神经纤维瘤的表现相关[8]。(2)大片段NF1基因缺失与大量神经纤维瘤、骨骼畸形、认知障碍以及发生恶性肿瘤等表现相关[9]。(3)包括整段NF1的基因微重复与无典型NFI临床表现相关，临床表现有生长迟缓、面部畸形、智力低下、癫痫发作[10]。

本病目前的治疗方法包括手术、药物、激光等，但均不是一劳永逸的方法，所以产前诊断显得尤为重要。Merker等[11]报道目前的技术可以帮助超过95%的NFI患者找到突变位点，因此受该病困扰的夫妇可以借助着床前胚胎遗传学诊断(PGD)来增加生育健康后代的几率。DeBella等[12]研究发现有97%的患者在8岁之前符合NIH发布的NF1诊断标准，乌云等[13]通过基因检测手段诊断2例仅有多发咖啡斑表现的无家族史低龄患儿，说明对于学龄前不符合诊断标准的疑似儿童进行基因检测，在早诊断、早干预方面有重要意义。该病无论从外观和健康方面对患者均是一种负担，本文中2例年轻女性患者有下一代产前诊断的需求，检测突变位点对她们日后优生优育有一定参考价值。

综上，本研究发现的3种新发突变丰富了中国人群NF1基因的突变谱，为NF1相关研究打下基础。对于临床表现未达诊断标准以及有遗传咨询需求的患者，可以考虑NF1基因突变分析，明确诊断并据病情发展行针对性随访观察。