李 捷，吴 颖

(国家知识产权局专利局专利审查协作四川中心，四川 成都 610213)

“酶制剂”是一个已有半个多世纪历程的产业，其完整的概念不仅仅包括酶制剂相关产品，同样还包括酶制剂的应用[1]。如今，酶制剂已成为一个具有高竞争力的高新技术产业，并仍保持着高速的发展态势。

诺维信是全球领先的生物技术公司，迄今为止，诺维信拥有约7000多项有效专利、正在申请的专利和专利许可。因此，笔者重点分析了诺维信在华酶制剂专利申请量趋势、主要酶产品“蛋白酶”的技术发展路线，以期为我国生物酶制剂创新主体在专利布局方面提供有价值的信息参考。

本文利用国家知识产权局自主开发的S系统，包括CNABS和SIPOABS数据库进行了检索，在检索过程中采用分类号和关键词相结合的方式进行。本文重点分析了申请量趋势、主要酶产品"蛋白酶"的技术发展路线。

1 申请量趋势分析

诺维信在中国最早的发明专利申请于1991年提交。之后专利申请量总体呈稳步上升趋势，期间偶有下降，在2012～2015年期间申请量明显上升，2015年时达到峰值(84件)。在建设生态文明的大政方针的指引下，诺维信公司与中国积极合作，并就环境友好型产品的技术加快了进入中国的步伐。2016～2018年的数据因一部分的未公开入库，有部分缺失，不能真实反映其申请量。

1.1 技术领域分析

为了了解和分析诺维信公司酶制剂相关的研究热点以及在华布局的技术热点，对检索得到的相关专利申请的主分类号进行了统计与分析，诺维信在华申请量最多的分类号集中在C12N小类下的3个大组分类号：C12N9/00(酶；酶原；其组合物，制备、活化、抑制、分离或纯化酶的方法)占78.46%、C12N15/00(突变或遗传工程；遗传工程涉及的DNA或RNA，载体(如质粒)或其分离、制备或纯化；所使用的宿主)占14.91%以及C12N1/00(微生物本身，如原生动物；及其组合物)占6.02%。其中，C12N9/00分类号释义：酶；酶原；其组合物，制备、活化、抑制、分离或纯化酶的方法。

其中，有关酶、其组合物、制备、活化、抑制、分离或纯化酶的方法的专利申请量占诺维信在华专利申请量的78.46%，这与诺维信的研发重心和生产销售主打产品是一致的。

1.2 重要技术专利情况

笔者还统计了诺维信蛋白酶制剂产品相关在华申请的技术主题类型，并根据这些主题类型对应申请数量的多少进行了排名。其中申请量最多的技术主题是方法，其次是组合物和蛋白酶及制剂。经查看相关申请文件发现，这些申请大部分都是围绕诺维信的主要业务路线进行的专利布局。诺维信公司的主要业务是通过发现、改良、生产和销售酶制剂和微生物制剂，将其产品应用于广泛的工业生产领域，诸如洗涤剂、食品、生物能源、纺织、皮革、造纸和饲料等40多个工业加工领域。首先通过发现新的蛋白质变体或特定功能域、挖掘新的突变位点，并对其进行改造，进而产生新的突变体以及能够用于工业生产酶的微生物，并将产生的蛋白酶产品申请专利，进而在相关组合物、添加剂(例如洗涤剂添加剂和饲料添加剂)、制备方法、用途等外围专利进行布局。另外，诺维信公司还有部分蛋白酶相关产品的申请涉及表达系统、宿主细胞、偶联物、缀合物等。

2 蛋白酶制剂专利技术路线分析

酶在洗涤剂工业中的使用已经超过了30年，其中最重要的酶是蛋白酶。蛋白酶是所有种类的洗涤剂中的标准成分之一。诺维信公司的蛋白酶产品主要包括枯草杆菌蛋白酶、金属蛋白酶等。枯草杆菌蛋白酶是一个典型组的细菌丝氨酸蛋白酶，由于它们在高温和碱性条件下的稳定性和活性，因此被广泛用于洗涤剂中，且成为了蛋白酶的研究热点，例如在新洗涤剂组合物的低温性能和开发，导致对新蛋白酶和其他类型的洗涤剂酶的研究燃起了新的兴趣。金属蛋白酶由于其在洗涤剂组合物中连同在洗涤过程期间的条件下的低稳定性，是一组目前较少地应用于洗涤工业中的蛋白酶，在商业上也并未取得较大的成功。

许多变体在不同的洗涤剂中具有提高的活性、稳定性和溶解性，然而不同的因素使得蛋白酶的优点有了进一步的提高。如温度和pH等清洗条件会随时间而发生变化，并且许多污渍在传统的清洗条件下仍然难以去除。由此可见，不论蛋白酶开发的深入研究如何，对于新的、改善的蛋白酶仍然存在需求，因此，对于诺维信公司酶制剂在华申请的主要产品-枯草杆菌蛋白酶及金属蛋白酶的技术路线都在一定程度上反映了诺维信公司的酶制剂领域在中国的布局及洗涤剂相关行业的发展方向。

2.1 枯草杆菌酶在中国申请的技术路线

1997年，诺维信公司在中国最早提出两件关于枯草杆菌酶的专利申请，分别涉及一种枯草酶变种及组合物，与其野生型亲本酶相比，这些突变体酶在任何去污剂中均表现出改良的洗涤效果。另一件申请同样涉及枯草杆菌酶突变体和组合物，其提供了通过诱变一系列枯草杆菌酶的基因并在合适的宿主中表达经诱变的基因而产生的酶。与其野生型母体酶相比，这些酶表现出增强的蛋白自身酶解稳定性。发现在特定位点上的一个或多个氨基酸残基进行改造的枯草杆菌酶变异体与相应的野生型相比，具有改变了的蛋白自身酶解降解模式。基本的改变是明显位于残基132～133(BASBPN编号)之间的自身酶解切割位点。这个蛋白自身酶解切割位点是被第一次确定为枯草杆菌蛋白酶中的初级蛋白自身酶解切割位点。1999～2000年，诺维信先后连续提交了7件申请，都是涉及在活性位点环区中具有额外氨基酸残基的I-S1和I-S2亚组枯草杆菌酶，且上述枯草杆菌酶变体在洗涤剂中的洗涤性能相比于其亲本酶都有所改良。2000～2001年，诺维信公司连续提交了4件涉及枯草杆菌酶变体及枯草杆菌酶的申请，并都表现出了优良的或改进的卵污渍洗涤性能，可以应用于如清洁或洗涤剂组合物中。在此基础上，诺维信公司之后分别在2004年、2010年先后提交了3件有关具有改善的蛋渍去除能力的枯草蛋白酶的申请，上述的枯草杆菌变体都具有例如改善的能够将煮熟的蛋黄从硬表面去除的能力。另外，对于洗涤剂的重要性能热稳定性的改进方面，也是诺维信公司研究的热点之一，且该研究热点基本上始终贯穿于其洗涤剂相关产品研发的路线，具体来讲，诺维信公司分别于2003、2006、2012年提出了3件申请。相比于热稳定性，另有几件申请在其他稳定性方面做出了改进，以适应不同的应用，除了前述诺维信在中国最早于1997年提出的涉及能够增强的蛋白自身酶解稳定性的枯草杆菌酶的申请以外，还有在2006年提交的涉及来自芽孢杆菌属的野生型菌株的枯草杆菌酶变体的申请，该申请中公开了其发明人已分离了属于枯草溶菌素家族的PD138样蛋白酶亚组的新蛋白酶，其具有低温时在洗涤剂中改进的性能；以及在2012年提交的申请中公开了发明人发现了特定强钙离子结合位点上具有改变的枯草杆菌酶，其中这些改变是取代或插入，导致变体在包含如EDTA等螯合剂的洗涤剂组合物中具有增加的稳定性，当与其亲本蛋白酶相比较时，增加了枯草杆菌酶变体在含有如EDTA等螯合剂的溶液中的稳定性；另外，还有两件分别于2015年以及2017年提出的申请，都涉及一种枯草杆菌变体具有在液体洗涤剂组合物中的稳定性增加。同时，统计数据中最晚于2017年提交的申请同样涉及酶的稳定化改进，具体地为可以使用肽醛向亚硫酸氢盐加合物的转化来增加在肽醛的纯化中的水溶解度，这种亚硫酸氢盐加合物本身作为枯草杆菌蛋白酶抑制剂和稳定剂不仅是有效的，而且它还可以稳定一种第二酶。该亚硫酸氢盐加合物作为枯草杆菌蛋白酶抑制剂是有效的，并且在储存过程中，它在液体洗涤剂中保持其抑制和稳定化作用。除了洗涤剂相关产品以外，诺维信还在2003年提交了一件涉及到能够在诸如洗涤剂和口腔护理产品中应用的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶的申请，该申请中公开了具有改变了的免疫原性的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶，尤其是具有降低了的变应原性的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶。

可见，诺维信公司在中国提交的专利申请中，有关枯草蛋白酶的申请主要致力于酶在洗涤剂中洗涤性能的优化以及稳定性例如热稳定性、液体洗涤剂中的稳定性的优化，且随着中国对于家居清洁不断提高的需求并同时结合近年来对于环境保护的重视程度不断加深，在例如去除纺织品以及硬表面的蛋渍能力加强的洗涤性能方面的酶制剂中也有较多的研究。除此以外，诺维信还同时在枯草蛋白酶的其他应用方面例如口腔护理产品中也有相关的研究，这体现出诺维信在以洗涤剂产品为主线的同时兼有对蛋白酶其他相关应用的研究。

2.2 金属蛋白酶

金属蛋白酶是对于其活性而言绝对需要金属离子的蛋白水解酶。尽管一些金属蛋白酶使用其他过渡金属，但大多数金属蛋白酶都是锌依赖性的。金属蛋白酶已经被广泛地用于不同工业中，像食品和酿造工业，其中一组已经用于各种应用中的金属蛋白酶是M4家族金属蛋白酶。通常，金属蛋白酶在常规洗涤条件下以及在常规洗涤剂组合物中是非常不稳定的，因此，金属蛋白酶在洗涤和清洁过程中以及在洗涤剂中的使用受到很大限制。

2.2.1 金属蛋白酶在中国申请的技术路线

1996年，诺维信公司提交了第一件有关金属蛋白酶的申请，该申请涉及表达水平降低的金属蛋白酶的宿主细胞和在蛋白质产生中使用该宿主细胞的方法，通过该方法，金属蛋白酶产生的蛋白酶解作用被明显减小，由此改善了由所述方法获得的蛋白质的稳定性。在1996年以后很长一段时期，诺维信一直没有就金属蛋白酶相关的产品或者方法等在中国提交过申请，直到2010年，提交了涉及具有减少的金属肽酶表达、适于重组多肽产生的突变细胞的申请，所述的突变细菌细胞失活了该发明中推定的金属蛋白酶能够产生至少一种目标异源多肽。之后，在2012年提交了3件有关包含金属蛋白酶的去污剂组合物的申请，分别涉及在40℃或更低的温度下具有增加的洗涤性能，具有热稳定性的金属蛋白酶，尤其在低温洗涤和去除蛋渍中的用途，以及进一步的改进的技术方案，具体改进为在在前申请的基础上，还可能导致减少的洗涤时间和pH，减少去污剂用量，并且环境友好。进一步地，在2013年提交了3件申请，分别涉及包括金属蛋白酶的洗涤剂组合物、来自脂环酸芽孢杆菌属的金属蛋白酶以及来自微小杆菌属的金属蛋白酶，研究重点依旧是在洗涤剂低温洗涤、蛋渍去除以及环境友好方面的改进。最近的有关金属蛋白酶的申请是2015年提交的2件申请。

3 总结与展望

从整体上看，诺维信从20世纪90年代就已经开始就酶制剂相关领域在中国申请专利，尤其是在洗涤剂领域商业应用最多的蛋白酶，一直是该公司研究的主要产品。同时，该公司除了研究改善的洗涤性能、稳定性等的蛋白突变位点的筛选以外，还随着中国居民生活水平的提高，对于家居清洁及其他生活用品需求水平的提高而相应增加该方面的专利申请。

相信，随着中国对于环境保护重视度的提高，以及与世界各国联系的加强，不仅是越来越多的诺维信公司的酶制剂产品进入我们的日常生活，更多更重要的是为我们带来更多先进的技术和理念，从而助力国内相关企业的发展。在提高国民生活水平的同时，也为我国的环保事业做出了巨大贡献。