王鹏飞,郭康,沈娟章,谭卫红

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所，生物质化学利用国家工程实验室，国家林业局林产化学工程重点开放性实验室，江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京，210042)

我国是核桃的生产大国，主要产区有新疆、云南、广西、河北、湖北、陕西、安徽等省。核桃营养价值极高，富含优质的脂肪、蛋白质、维生素以及微量元素，具有健脑益智、降血脂、抗氧化、降血糖、预防癌症等功能[1]。核桃的品质受到产地的影响，具有很强的地域特征。有学者研究表明，不同产区的核桃受土壤、气候、湿度等环境因素影响，使得核桃的营养成分不同[2]。因此有必要保护地域特色食品，我国颁布的《地理标志产品保护规定》明确规定特定地域，具有质量、声誉的产品受法律保护，目前也有相关的核桃地理标志，但是如何鉴别确认不同产地的核桃是当前需要解决的问题。

近年来，稳定同位素技术发展快速，该技术利用生物体内同位素组成受气候、土壤、地形以及自身代谢等因素影响的特征[3]，在农产品产地溯源和掺假检测等许多领域逐渐得到应用，目前已经成功应用于茶叶[4]、黑加仑[5]、橄榄油[6]、甜椒[7]等产品的产地溯源。有时为了提高产地溯源的判别率，可通过将稳定同位素结合产品的其他检测指标，如有机成分[8]，无机元素[9-10]，有机、无机元素相结合[11]等。虎海防等[12]利用核桃中碳水化合物含量的差异对新疆不同产地的核桃进行鉴别，而利用稳定同位素技术和有机成分联合判别核桃产地来源，目前还未见报道。实验的创新点在于将稳定同位素技术应用于核桃产地溯源中，主要内容是研究核桃的碳、氢、氧、氮同位素组成以及粗脂肪、粗蛋白含量在不同地区的差异，并利用粗脂肪、粗蛋白含量辅助稳定同位素指标对不同产地的核桃进行判别分析。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料

元素分析-稳定同位素质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司)；FLASH 2000 HT型元素分析仪；连续流接口装置Conflo IV；DELTA V ADVANTAGE稳定同位素质谱仪；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱。

碳、氮同位素标准物质咖啡因(IAEA-600，δ13C：-27.771‰±0.043‰，δ15N：+1.000‰±0.2‰)；氢同位素标准物质聚乙烯(IAEA-CH-7，δ2H：-100.3‰±2.2‰)；氧同位素标准物质苯甲酸(IAEA-601，δ18O：+23.330‰±0.3‰)，均购于奥地利维也纳国际原子能机构。

实验涉及到气体均为高纯气体，购于南京麦克斯韦气体有限公司。

实验收集344个核桃样品，其中河南省121个，甘肃80个，云南省23个，四川省20个，陕西省20个，新疆20个，湖北20个，河北20个，广西20个，样品的具体地域信息见表1。

1.2 样品预处理

核桃去壳，核桃仁用研钵磨碎，置于60 ℃烘箱干燥24 h除去水分，于0 ℃密封储存待测。

1.3 样品测定

1.3.1 粗脂肪含量

参照GB/T.5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定 》，采用索式提取法测定。

表1 核桃采样地域信息Table 1 Walnut sampling area information

1.3.2 粗蛋白含量

用EA2400 SeriesⅡ元素分析仪测定氮元素含量，粗蛋白含量为氮元素含量乘以6.25[13]。

1.3.3 稳定碳、氮同位素测定

称取0.25～0.3 mg待测样品，用锡杯包裹，由元素分析仪自动进样器将样品送入动态快速燃烧炉。在装有纯氧、氧化还原剂的燃烧炉中，样品的中的碳元素转化为CO2，氮元素转化为N2。经过吸水柱除水干燥，然后经过CO2、N2分离色谱柱分离，最后经Conflo IV稀释后进入同位素比率质谱仪测试。

检测条件：氧化炉温度为960 ℃，载气流速为100 mL/min，样品吹扫气流速为225 mL/min，氧气流速为175 mL/min，注氧时间为3 s，气相色谱柱温度为50 ℃。

1.3.4 稳定氢、氧同位素测定

称取约0.25～0.3 mg待测样品，用银杯包裹好置于元素分析仪自动进样器中，样品送入高温裂解炉，裂解炉中的玻璃碳直接将样品中H和O元素转化成H2和CO，经过H2、CO分离色谱柱分离后，最后经过Conflo IV稀释后进入质谱系统。

检测条件：裂解炉温度为1 400 ℃，载气流速为100 mL/min，样品吹扫气流速150 mL/min，气相色谱柱温度为90 ℃。

1.3.5 数据处理

使用Isodat 3.0软件对稳定同位素比值进行计算，用统计产品与服务解决方案SPSS20.0软件对数据进行方差分析，单因素显著性差异分析并作图，利用线性判别分析各产地的判别率。线性判别分析是常用的判别方法，其原理是根据样本的类内方差最小和类间方差最大的原则，构建2个判别函数，利用这2个判别函数对样本进行分类。

2 结果与讨论

2.1 地域差异分析

2.1.1 碳同位素

由表2可知，不同地区核桃中δ13C值在-27.474‰～-25.718‰，样品的变化幅度较小，δ13C值由小到大的顺序为湖北<新疆<河北<云南<甘肃<四川<广西<河南<陕西。从图1-a发现，新疆、河北、湖北、云南4省的样品与河南、甘肃、陕西、四川的样品重叠部分较少，区分明显；而广西样品δ13C值波动范围最大，与其余各地都存在重叠，较难区分。

表2 不同省份间核桃各组分的测定结果Table 2 Determination of different components of walnut in different provinces

注：数据为平均值±标准偏差；不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)。下同。

图1 不同地区核桃稳定同位素及有机成分箱图Fig.1 Different regions of walnut stable isotopes and organic composition box map

在河南省的亚地区中发现，δ13C值的变化顺序为济源市<内乡县<林州市<嵩县<卢氏县，结合样品采样地域信息表3发现，δ13C值随海拔高度的增加而增加，这与周咏春等[14]的研究结果一致。可能是因为随着海拔的增高，大气压降低，导致植物叶片内外CO2的分压降低，碳同位素的分馏作用减小，从而造成这一变化趋势[15]。但这一变化趋势在各省之间没有体现出来，因为除了海拔，碳同位素还受到温度、光照、土壤含水量[16-18]等影响。

表3 河南省亚地区核桃各组分含量Table 3 The content of walnut in sub-region of Henan province

2.1.2 氢同位素

各地区δ2H值的范围在-214.377‰～-162.501‰，其中以河北样品最高，云南样品最低。从图1-b中看出各省的δ2H值分布为3个梯度，新疆与河北样品有较大的重叠，两者之间难以区分，但与其他地区区别显著。河南、甘肃、陕西样品的δ2H均值都在-177‰附近，重叠最大，无显著性差异(P>0.05)。四川、湖北、甘肃样品的δ2H值逐渐减小且少有重叠，三者之间容易区分。广西省样品的δ2H值波动范围较大，除与云南、湖北样品有少许重叠外，与其他各省的区别明显。由图1-b能够看出核桃中的δ2H值大体上有着随纬度的降低而减小的趋势，这与马奕颜等[19]的报道一致。而在河南省的亚地区发现，随着纬度的降低，δ2H值呈现出先减小后增大的趋势。氢同位素的分馏并不仅受到纬度的影响，同时也与温度[20]、降水[21]、海拔[22]等因素影响有关。结合表1和图1-b发现新疆阿克苏的纬度高于河北，但是新疆的样品的δ2H值却低于河北样品，同样的情况还出现在广西和云南之间。研究表明在水汽输送过程中，由于重同位素先于轻同位素下降，δ2H值由海岸向内陆方向呈递减的趋势，即大陆效应[23]。新疆相对河北在遥远的内陆，有可能此时的大陆效应强于纬度效应，导致新疆样品的δ2H值小于河北样品。此外，植物中的δ2H值随海拔的升高而降低[19]，云南省核桃产区的平均海拔约为1 541 m，远大于广西省的138 m，因此有可能δ2H值受到海拔的影响较为显著，导致云南省样品的δ2H值小于广西省。

2.1.3 氧同位素

δ18O值的范围在13.574‰～25.107‰，以广西核桃最低，新疆核桃最高。河北样品的δ2H值波动最大，与新疆样品的重叠最多，两者之间无显著性差异(P>0.05)难以区分，但是两者与其余各省的样品区别明显。此外，陕西样品与河南、甘肃样品也有较多的重叠。根据表1和图1-c发现，不同产地核桃的δ18O值随纬度的减小而减小，其趋势与δ2H值变化相似。这也符合由于氢和氧都是水的组成元素，在水循环过程中两者具有相似的分馏作用这一观点[23]。但是在河南省的亚地区发现δ18O值随纬度的减小，呈现出先增大后减小的趋势，这与亚地区氢同位素的变化趋势相反，还需深入研究。

2.1.4 氮同位素

由图1-d知，不同来源的核桃δ15N值变化幅度较大，在-2.735‰～4.115‰，依次排序为河南<甘肃<四川<河北<新疆<陕西<云南<广西<湖北。河南样品的δ15N值最低，且与其他各省的样品都没有重叠。四川与甘肃之间重叠较多，不易区分，但两者与其余各地的差异较为明显。氮元素的分布与碳、氢、氧同位素的分布差异较大。这是因为植物中的δ15N值主要受到土壤中氮元素的影响，而土壤中的氮则取决于气候、地理条件以及农业施肥[24]。土壤中δ15N值与土壤的湿度相关，湿度大的区域δ15N值小，干旱的地区δ15N值较高[25]。农业施肥受到人为因素的影响较大，化学肥料的δ15N值在-2‰～2‰，而有机肥料的δ15N值在0.6‰～36.7‰，过多的使用化学肥料也会导致土壤中δ15N值贫化[26]。

2.1.5 有机成分

由图1-e、1-f可知不同产地的核桃粗脂肪含量多数集中在70%附近，其中云南省样品的粗脂肪含量最高，平均含量为(73.75±6.54)%，广西省样品的粗脂肪含量最低，平均含量为(60.75±5.69)%，广西省与其他各省没有重叠差异。单因素方差分析显示，除广西省外，其余各省之间无显著性差异(P>0.05)。不同地区核桃的粗蛋白含量集中在21%附近，河南省样品中的粗蛋白含量最高，平均含量为(22.40±3.20)%，甘肃省样品的粗蛋白含量最低，平均含量为(19.40±4.77)%， 各省之间也无显著性差异(P>0.05)。

2.2 判别分析

2.2.1 对不同省份核桃的判别分析

利用线性判别分析法分析各指标对核桃产地的判别影响，结果如图2所示。利用δ13C、δ2H、δ18O、δ15N值对核桃产地进行判别时，对河南省样品的正确判别率最高，为87.6%，甘肃省最低，只有41.3%。其他省份的正确判别率依次为新疆70.0%，河北60.0%，陕西80.0%，四川85.0%，湖北78.9%，云南73.9%，广西70.0%，总体正确判别率为71.1%。

图2 不同省份间核桃产地判别结果Fig.2 Discrimination results of walnut origin in different provinces

将核桃的δ13C、δ2H、δ18O、δ15N值与粗脂肪、粗蛋白结合判别分析，可以看到各产地有两个省的正确判别率达到了90.0%以上，分别为新疆95.0%，广西90.0%。其余各省的正确判别率也有不同幅度的提升，河北70.0%，河南88.4%，陕西85.0%，四川85.0%，湖北78.9%，云南87.0%，甘肃省样品的判别率仍然最低，但也提升到57.5%。总体的正确判别率提升到了79.6%，说明稳定同位素结合有机成分能提高对核桃产地的判别效果。

2.2.2 对河南省亚地区核桃的判别分析

如图3，在利用δ13C、δ2H、δ18O、δ15N值对河南省亚地区核桃产地判别时，发现亚地区的正确判别没有省份之间的高。在河南省的亚地区中，嵩县样品的正确判别率最高，也才达到68.2%，其余各亚地区的判别率为卢氏县56.0%，林州市48.0%，济源市60.0%，内乡县57.9%，总体的正确判别率为57.9%。在结合了有机成分判别后，5个地区的总体正确判别率提高至68.6%，其中林州市提升最多，达到72.0%，其余各地的正确判别率为：嵩县77.3%，卢氏县60.0%，济源市66.7%，内乡县68.4%。可见，相比于各省之间，河南省亚地区的判别率要低，可能是由于各地区之间距离较近，同位素与有机成分的差异不明显所致。

图3 河南省亚地区核桃产地判别结果 Fig.3 Discrimination results of walnut origin in sub-region of Henan Province

3 结论

不同地区核桃的碳、氢、氧、氮同位素具有明显的地域特征，在结合核桃的粗脂肪、粗蛋白含量后，能显著提高各地区的正确判别率，说明稳定同位素结合有机成分这一方法能够较为有效地用于核桃产地的区分。