王琪，刘聪，景彦萍，张敏，范三红

(山西大学 生命科学学院，山西 太原，030006)

乳酸菌是发酵碳水化合物产生大量乳酸的一大类细菌。绝大部分乳酸菌是正常人、畜体内极其重要的菌群，具有维持微生态平衡、提高免疫力、改善乳糖不耐症等多种益生作用[1]，因此在食品、医药等行业中应用非常广泛。

传统发酵食品是利用有益微生物发酵谷物、豆类、乳、蔬菜及肉类等制成的食品，如醪糟、酸奶、泡菜、发酵香肠等[2]。目前已有大量研究发现传统发酵食品中的乳酸菌具有潜在的益生特性[3-6]。同时，随着抗生素的广泛使用，益生菌的耐药性也越来越受到关注[7-8]。

晋西北酸粥是一种风味独特、酸香浓郁的传统谷物发酵食品，它以糜米为主要原料，经微生物自然发酵而成。本文对晋西北酸粥发酵液中的乳酸菌进行了潜在益生特性和抗生素耐药性的研究。这不仅可为晋西北酸粥的工业化生产提供理论指导和菌株保障，同时也可为功能性益生菌剂的开发及发酵食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20株乳酸菌：本实验室从晋西北酸粥中分离并于-80 ℃保存于含保护剂的MRS培养基中；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC 25923)，购于中国微生物菌种保藏管理中心。

牛胆盐、胆固醇、细菌基因组DNA抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA分子质量标准、抗生素等，生工生物工程(上海)股份有限公司。

MRS液体培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、K2HPO42 g、柠檬酸氢二铵2 g、乙酸钠5 g、MgSO40.5 g、MnSO40.25 g、Tween-80 1 mL，蒸馏水1 000 mL，调pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。

MRS固体培养基：向1L MRS液体培养基中加20 g琼脂，调pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。

MRS-THIO液体培养基：向100 mL MRS液体培养基中加入0.2 g硫代乙醇酸钠，待充分溶解后，用1 mol/L 乙酸调pH 6.5，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

ZWY-240恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱、XM- 30R立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HC- 2518高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；Centrifuge 5430R小型台式高速冷冻离心机，德国艾本德公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪，Gel Doc 2000 UV凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；YQX-Ⅱ厌氧培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的配制

将活化后的菌株接种至MRS液体培养基中振荡(150 r/min)传代培养。将第3代培养物8 000×g离心10 min，取菌体沉淀用无菌PBS缓冲液(pH 6.5)洗涤3次后重悬，得到菌悬液。

1.3.2 菌株的耐酸能力测定[9]

取上述菌悬液，按φ=5%比例分别接种于pH值3.0和正常pH的MRS液体培养基中，混匀后于37 ℃厌氧培养。分别在接种后0 h和2.5 h取培养物，稀释涂布MRS平板于37 ℃厌氧培养48 h后计数，按公式(1)计算存活率。

(1)

式中：N1和N2分别为菌株接入pH 3.0的MRS液体培养基中培养2.5 h和0 h后的活菌数。

选取存活率≥50%的菌株，接种到pH 3.0的MRS液体培养基中，于37 ℃厌氧培养24～96 h，若液体培养基变混浊，则菌株耐酸。

1.3.3 菌株的耐胆盐能力测定[10]

将活化后的菌株按φ=3%接种量分别接种于含0.3、0.5、0.7 g/100 mL牛胆盐的MRS液体培养基中，于37 ℃厌氧培养24 h，测定各菌液在560 nm的吸光度，以不添加牛胆盐的培养物为对照。

1.3.4 菌株的疏水性测定[10]

将活化的菌株接种至MRS液体培养基中，于37 ℃厌氧培养24～48 h，8 000 ×g离心10 min，沉淀用除氧无菌PBS缓冲液(pH 6.5)洗涤3次后重悬，并调整密度使其A560nm值为1。取该菌悬液各4 mL，分别加入0.8 mL的甲苯和十六烷作为吸附剂，涡旋振荡，待静置分层后，取下层水相，测定其A560nm值。以无菌PBS缓冲液作空白对照，按公式(2)计算疏水率。

(2)

式中：A0和A1分别为菌液与吸附剂混匀前和混匀后的吸光度。

1.3.5 菌株的体外降胆固醇能力测定

将活化后的菌株按φ=53%接种量分别接种于含0.01 g/100 mL胆固醇的MRS-THIO液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，8 000 ×g离心10 min，收集上清液。采用邻苯二甲醛比色法[11]测定上清液中胆固醇含量，按公式(3)计算菌株的胆固醇降解率。

(3)

式中：A0和A1分别为未接菌的含胆固醇培养基和上清液在550 nm波长处的吸光度。

1.3.6 菌株的体外抗氧化活性测定

1.3.6.1 无细胞提取液的制备

将活化好的菌株按φ=3%接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，8 000 ×g离心10 min，收集菌体，用除氧无菌PBS缓冲液(pH 6.5)洗涤3次后重悬，调整菌体密度分别为108、109、1010CFU/mL，每100 mL分别添加0.1 g溶菌酶，37 ℃恒温水浴30 min，冰浴超声破碎菌体(800 W，超声2 s，间隔2 s，共15 min)，于4 ℃、10 000 ×g离心20 min，上清液即为无细胞提取液，4 ℃保存待测。

1.3.6.2 菌株对过氧化氢的耐受性测定[5]

将活化好的菌株按φ=1%接种量分别接种于含不同浓度(0、0.4、0.7、1.0 mmol/L)过氧化氢和不含过氧化氢的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养8 h，8 000 ×g离心15 min，收集菌体，使用除氧无菌PBS缓冲液(pH 6.5)洗涤3次，并重悬，测定A600nm值。

1.3.6.3 菌株清除羟自由基(·OH)能力的测定[5]

取0.435 mmol/L的亮绿l mL，0.5 mmol/L的FeSO42 mL，3 g/100 mL的过氧化氢1.5 mL，1 mL不同菌悬液密度的无细胞提取液，混匀，37 ℃水浴20 min。8 000 ×g离心15 min，取上清液测定A624nm值。按公式(4)计算·OH清除率。

(4)

式中：A为无Fenton试剂、无样品、有亮绿体系的A624nm值；A0为有Fenton试剂、无样品、有亮绿体系的A624nm值；As为有Fenton试剂、有样品、有亮绿体系的A624nm值。

1.3.6.4 菌株清除DPPH自由基能力的测定[12]

取1 mL不同菌悬液密度的菌液加入2 mL DPPH- 甲醇溶液(0.1 mmol/L)，混匀后室温避光反应30 min，8 000 ×g离心15 min，取上清液测定A517nm值，用无菌水空白调零。空白组以等体积甲醇代替DPPH溶液，对照组以等体积无菌水代替菌液。按公式(5)计算DPPH自由基清除率。

(5)

式中：A、A0、As分别为空白组、对照组、样品组的A517nm值。

1.3.7 乳酸菌16S rDNA序列的测定

用试剂盒分别提取每株菌的基因组DNA，经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。采用细菌16S rDNA的通用引物338F-806R扩增V3～V4区序列。338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。反应体系(50 μL)：2×Taq PCR Master Mix 25 μL；引物(20 mmol/L)各5 μL；模板2 μL；ddH2O补至50 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环后，72 ℃保温10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后回收并测序。测序结果在GenBank中进行BLAST比对，并提交序列至NCBI获得接收号(accession number)。

1.3.8 药物敏感性测定[13]

药敏纸片的制备：将直径为7 mm的圆形滤纸片完全吸附以下不同效价的抗生素，氨苄青霉素、链霉素、氨苄西林均为10 μg，红霉素15 μg，头孢噻肟、氯霉素和四环素均为30 μg[14]。

采用药物纸片琼脂扩散法测定菌株的药敏性。将菌株分别接种于MRS液体培养基中，于37 ℃厌氧培养24～48 h，离心收集菌体，用无菌生理盐水配成含菌数为107CFU/mL的菌悬液，取100 μL菌悬液均匀涂布于MRS平板，待平板表面干燥后将药敏纸片贴于表面，每个平板内等间距放置3张含有同种抗生素的纸片，37 ℃厌氧培养24 h，测量抑菌圈的直径。重复3次取平均值。质控菌株为金黄色葡萄球菌，结果参照WHO提供的NCCLS最新版本的标准进行判定。

1.4 数据处理

数据以平均值±标准差表示，采用SPSS17.0软件利用Ducan多重比较法进行差异显著性比较，以P<0.05表示组间具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 菌株的耐酸能力

作为益生菌的首要条件是能耐受胃酸[9]。人体胃液的pH值通常小于2，饭后被稀释上升至3.5左右，食物通过胃的时间为1～2 h[9]。由图1可知，在pH值为3.0的条件下培养2.5 h后，存活率大于50%的菌有14株；其中M-8、M-9、M-10、M-12、M-13和M-15的存活率超过100%。张和平等[15]发现内蒙古酸马奶中的LactobacilluscaseiZhang和LactobacillusacidophilusZL12- 1在pH值3.0培养3 h后的存活率达50%。

将上述存活率≥50%的菌在pH值为3.0的MRS液体培养基中37 ℃培养24～96 h后以下14株菌可以生长：M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-8、M-9、M-10、M-12、M-13、M-15、M-16、M-17和M-19。张和平等[15]发现发酵乳中的干酪乳杆菌在pH值为2.0～5.0的人工胃液中3 h后存活不受影响。

图1 菌株在pH 3.0的MRS液体培养基中2.5 h后的存活率Fig.1 The survival rate of strains after 2.5 h in MRS liquid medium of pH 3.0

2.2 菌株的耐胆盐能力

益生菌必须能耐胆盐[9]。尽管目前没有确定益生菌能耐受的肠道胆盐的最高浓度，但筛选能耐受高浓度胆盐的菌株却是非常必要的[16]。由表1可知，不同乳酸菌在不同胆盐浓度下的生长情况各异；随着胆盐浓度的升高，菌株生长变慢；在相同胆盐浓度下，各菌株的生长存在显著性差异(P<0.05)； M-1、M-5、M-7、M-8、M-9、M-10和M-13对胆盐的耐受性较强。

表1 不同胆盐质量浓度下菌株的生长情况Table 1 Tolerance of the strains to bile salts of different concentrations

注：同列带不同小写字母的数据差异显著(P<0.05)。

其中，M-5在含0.7 g/100 mL胆盐的培养基中仍能生长。王立平等[17]从蒙古酸马奶中筛出的嗜酸乳杆菌能耐受胆盐的最大浓度为0.6 g/100 mL，张和平等[15]从内蒙古酸马奶中分离的干酪乳杆菌能耐受胆盐的最大浓度为1.6 g/100 mL。

2.3 菌株的疏水性

黏附是益生菌在人体消化道内定植并发挥作用的基础[18]。菌体的表面疏水性能反映其黏附力，疏水性越强，黏附力越强。由图2可知，20株乳酸菌对甲苯和十六烷的黏附能力不同；M-5、M-10、M-17和M-19对甲苯和十六烷的吸附力较强，其中最强的是M-19，对甲苯和十六烷的疏水率分别为15.44%和16.42%。这与文献中报道的疏水率还有一定的距离[19-20]。

图2 菌株的疏水性比较Fig.2 Comparison of the hydrophobicity of the strains

2.4 菌株的体外降胆固醇能力

过量胆固醇与心脑血管疾病密切相关[20]。由图3可知，有12株菌对胆固醇的降解率超过50%；其中M-10的降解率最高(84.11%)。这远高于文献中的结果，L.caseiZhang的降解率为49.61%[15]，嗜酸乳杆菌的降解率为50%[17]。

图3 菌株的体外降胆固醇能力比较Fig.3 Comparison of the cholesterol-reducing ability in vitro of strains

2.5 菌株的体外抗氧化活性

对H2O2的耐受性是评价抗氧化性的重要指标。由表2可知，随着H2O2浓度的升高，菌株的耐受性降低；在相同的H2O2浓度下，各菌株的耐受性存在显著性差异(P<0.05)；其中M-4、M-1和M-8的耐受性较强。侯保朝等[21]发现乳酸菌SC608能耐受的H2O2浓度为1 mmol/L。

表2 不同H2O2浓度下菌株的生长情况Table 2 Tolerance of the strains to hydrogen peroxide of different concentrations

注：同列带不同小写字母的数据差异显著(P<0.05)。

羟自由基(·OH)是最主要的导致脂质过氧化的自由基[22]。对(·OH)的清除力也是反映菌株抗氧化能力的重要参数。由图4可知，20株乳酸菌都有一定的(·OH)清除力；随着菌液密度的增加，清除率不断提高；其中M-20在菌液密度为1010CFU/mL时的清除率最高(33.07%)。这远高于王曦等[23]、刘洋等[24]报道的乳酸菌的清除率，但是低于蒋琰洁等[25]测定的面包乳杆菌的清除率(48%)，远低于王刚等[26]研究的植物乳杆菌和干酪乳杆菌的清除率(分别为83%和95%)。

图4 菌株对(·OH)的清除能力比较Fig.4 Comparison of the strains for scavenging activities on hydroxyl radicals

对DPPH自由基的清除效果也是评价菌株抗氧化性的重要指标[27]。由图5可知，20株乳酸菌对DPPH自由基的清除能力差别很大；随着菌液密度的增加，清除能力不断提高；在菌液密度为1010CFU/mL时，有10株菌对DPPH自由基的清除率大于50%，其中M-16的清除率最高(84.65%)。这远高于文献中的结果[24-25, 28-30]，而稍低于王曦等[23]报道的结果(98.15%)。

图5 菌株DPPH自由基清除能力的比较Fig.5 Comparisons of the strains for scavenging effects on DPPH free radicals

综合上述3个抗氧化性指标，得出M-8的抗氧化能力较强。

总之，对于20株乳酸菌首先从耐酸性筛选到存活率大于50%的14株菌，接着对这14株菌进行耐胆盐和疏水性筛选后剩余9株菌，再对这9株菌进行降胆固醇和抗氧化性筛选后剩余4株菌。需要特别说明的是，M-15的降胆固醇能力非常强，而且对·OH的清除率很高；虽然其耐胆盐能力相对而言最弱，但是其耐胆盐能力的绝对值并不低，且它能在胆盐环境中生长，只是速度慢些，故也被选中。因此，具有潜在益生特性的5株菌是：M-1、M-5、M-8、M-10和M-15。

2.6 菌株16S rDNA序列分析

对上述5株益生菌提取基因组DNA后进行16S rDNA V3-V4区的PCR扩增，扩增产物经电泳检测在约500 bp处有较浓的单一条带，符合理论值(图6)。这5株菌的16S rDNA序列均与短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的同源性为99%(表3)。结合前期的形态观察、生理生化特征，将这5株菌均鉴定为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，NCBI接收号为MG722897-MG722901。

Mr：100 bp DNA ladder marker；Lane 1：M-1；Lane 2：M-5；Lane 3：M-8；Lane 4： M-10；Lane 5：M-15图6 五株菌16S rDNA的PCR扩增产物电泳图Fig.6 Electrophoresis analysis of 16S rDNA amplification products of five strains

表3 五株菌的16S rDNA序列的比对结果Table 3 Blast results of 5 strains by 16S rDNA sequences

2.7 乳酸菌的药敏性分析

通过对益生菌进行药敏性测定，可避免耐药基因由于益生菌的广泛使用而传播。由表4可知，5株益生菌对不同抗生素的耐药性不同；对青霉素、头孢噻肟、四环素和链霉素均有耐药性，这与凡琴等[31]的结果相似；对氨苄西林、红霉素和氯霉素均敏感，且敏感度不同，这与杨吉霞等[13]的结果一致。

表4 五株菌对抗生素的耐药性Table 4 Antibiotic resistance of 5 strains

注：S-敏感；I-中度敏感；R-耐药。

3 结论

本文研究了20株乳酸菌的潜在益生特性和药敏性。菌株M-8、M-9、M-10、M-12、M-13和M-15的体外耐酸性非常强；M-1、M-5、M-8、M-9、M-10和M-13对胆盐的耐受性较强；M-19的疏水性最强；有12株菌对胆固醇的降解率大于50%；M-1、M-4和M-8对H2O2的耐受性较好，M-12和M-20对(·OH)的清除率最高，M-5和M-1对DPPH自由基的清除率最高。综上，M-1、M-5、M-8、M-10和M-15具有潜在益生特性，均为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)。这5株菌对青霉素、头孢噻肟、四环素和链霉素耐药，对氨苄西林、红霉素和氯霉素敏感。