靳文学 乔秀兰

(重庆市中医院 1心血管科，重庆 400021；2针灸科)

急性心肌梗死(AMI)是全球发病率较高的一种疾病，外科手术和介入治疗是AMI目前主要临床传统疗法，此两种疗法均旨在重新建立血供，但对损伤的心肌组织和细胞并无修复效果。内皮祖细胞(EPCs)是与血管新生有关的骨髓干细胞亚群〔1〕，国内外诸多研究已经表明，EPCs在重建血供〔2〕、促进缺血性组织血管新生〔3〕，向心肌细胞和内皮细胞等细胞的分化〔4,5〕、缓解内皮功能障碍的肺动脉高压〔6〕及肿瘤防治等方面有卓越表现。在AMI治疗方面，EPCs移植也表现出了令人满意的疗效，EPCs移植可促进血管重建，改善心脏功能；向毛细血管内皮细胞分化，促进心肌梗死的恢复，改善心脏功能〔7～9〕。远志是我国传统的药材，其主要的活性组分有皂苷类、黄酮类、寡糖酯和生物碱等。远志皂苷元是其药理作用的主要活性成分之一，其在抗氧化、抑制炎症、抗衰老及抗细胞毒性方面疗效卓著〔10〕。在AMI进程中，心肌缺血再灌注会加剧内质网应激，引发心肌细胞凋亡，加重心肌梗死危害〔11〕，李子希等〔12〕研究表明，远志皂苷元可通过缓解内质网应激保护心肌。此外，远志皂苷元可促进血管内皮细胞增殖和活化，抑制内皮细胞的凋亡〔13～16〕。据此推测，远志皂苷元可提高EPCs移植的作用效果，然而目前远志皂苷元对EPCs移植治疗心肌梗死大鼠影响的研究尚为空白。本文旨在探讨远志皂苷元干预和EPCs移植联合治疗对AMI大鼠心功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 80只体重300～350 g健康SD大鼠(2.5月龄左右，雄性)由重庆医科大学提供，室温25℃，湿度50%～80%，SPF环境下自由饮水和采食，许可证号：SCXK(渝)2012-0001。

1.2主要材料 实验所用显微镜均由上海仪圆光学提供，二氨基联苯胺(DAB)购自北京化学试剂集团有限公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)由Hyclone提供；细胞培养箱购自Heraeus Sepatech 公司。外周血内皮祖细胞由华中科技大学同济医学院附属协和医院提供。EBM-2培养基、胎牛血清均购自Hyclone；Trizol试剂盒购自Invitrogen；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度试剂盒(增强型)、5×十二烷基磺酸钠(SDS)蛋白上样缓冲液、20×三乙醇胺缓冲盐水(TBS)缓冲液等购自南京建成生物。SP-DiI染料购自北京大清生物技术有限公司；血管内皮生长因子(VEGF)抗体购于北京百迈客生物科技有限公司，β-actin抗体购于艾康生物技术(杭州)有限公司。生理盐水从上海交通大学医学院附属仁济医院购进。超净工作台提供自艺斯高上海贸易有限公司。荧光染色溶液的配制：将2.5 g SP-Dil染料用1 L的二甲基酰胺(DMF)溶解。远志皂苷元购自上海诚凛生物科技有限公司。

1.3建立大鼠模型及实验分组 取80只SD雄性大鼠建立AMI模型：麻醉大鼠，气管插管进行机械通气并密切监测心电变化。对所有实验大鼠开胸，辨认并结扎左冠状动脉前降支近段，以结扎冠状动脉后心肌颜色变暗、心脏变大、左室前壁局部心肌运动明显减弱及心电图ST段抬高为标准判定AMI模型建立成功与否。判定后缝合大鼠胸部切口后将之放回笼中饲养，将实验大鼠平均随机分为四组：AMI对照组(组Ⅰ)、远志皂苷元治疗组(组Ⅱ)、EPCs移植组(组Ⅲ)、EPCs移植联合远志皂苷元治疗组(组Ⅳ)，各20只。

1.4体外复苏并培养扩增大鼠外周血EPCs 将冻存原代EPCs置于60℃恒温水浴箱，30 s内进行EPCs快速复苏。融化之后迅疾转入EP管并加入EBM-2培养基，重复小心吹打细胞使其均匀分布，随后离心弃上清液。将复苏后的细胞用EBM-2完全培养基调整为1×106/ml的密度。进行培养待EPCs汇合度达80%以上时，胰蛋白酶溶液消化2～3 min后终止消化；离心弃上清重悬细胞。调整细胞密度至1×106/ml培养7 d。离心弃上清，将EPC细胞密度调整为8×105/ml，加入5 μl CM-Dil标记细胞；随后置于培养箱中标记孵化25～30 min后离心弃上清PBS重悬，重复标记两次，显微镜下观察细胞标记的情况。镜下可见EPCs标记显现出鲜艳的橘红色，且颜色均匀，备用。实验大鼠建模1 h之后，进行EPCs移植和远志皂苷元干预治疗。将100 μl CM-Dil标记好的EPCs细胞悬液分5点分别注射到组Ⅲ及组Ⅳ心肌梗死区域的边缘，尾静脉注射100 μl生理盐水；将100 μl生理盐水分5点分别注射组Ⅱ大鼠心肌梗死区边缘，组Ⅱ和组Ⅳ尾静脉注射3 mg/ml远志皂苷元溶剂；分别于组Ⅰ心肌梗死区域边缘和尾静脉注射与上述EPCs混悬液和远志皂苷元试剂相同体积的生理盐水；连续治疗3 d。

1.5超声心动图检测大鼠心功能改变及毛细血管密度 EPCs移植后3 w及6 w，分别从各个实验组选取5只大鼠进行心功能变化测定。采用超声诊断仪记录3个心动周期左室收缩末期内径(LVDs)、左室舒张末期内径(LVDd)、左室前壁舒张末期厚度(LVAWd)、左室舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)并计算左室射血分数(LVEF)的平均值。于移植后3 w和6 w，处死大鼠迅速打开其胸腔，剥离出大鼠心肌梗死组织将之分为3份：1份置于液氮中备用；1份石蜡组织制片备用免疫组化染色；1份冰冻组织切片备用苏木精-伊红染(HE)染色。对心肌梗死组织进行石蜡包埋组织切片，CD34免疫组化染色并于显微镜下计数平均毛细血管密度。

1.6逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定梗死周边区VEGF基因及蛋白的表达 研磨匀浆大鼠心肌梗死组织并提取组织的总RNA，通过Primer Primer5.0软件设计引物，VEGF引物序列上游：5′-AGAAGGAGGAGGGCAGAATCA-3′；下游：5′-CAAATGCTTTCTCCGCTCTGA-3′，目的片段长度326 bp；参照物β-actin引物序列上游：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′；下游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGCGTGAC-3′，片段长度为471 bp。反应后琼脂糖凝胶电泳并成像仪摄片，用Image proplus6.0图像分析软件测算电泳条带的OD值，进而计算其相对表达量。取大鼠心肌梗死区域组织匀浆液，4 000 r/min离心取组织上清液，用ELISA试剂盒(购自南京建成生物有限公司)测定VEGF含量。根据免疫显色反应的当量关系可知实验大鼠心肌梗死组织的VEGF水平。

1.7荧光显微镜观察心肌内移植内皮祖细胞EPCs 干预治疗3 w和6 w之后制作大鼠心肌梗死组织冰冻切片并进行4′，6-二脒基-2苯基吲哚染色。干燥后，显微镜下观察时，随机选取每张冷冻切片的3个视野并且对之进行拍照记录；假设每张照片的总亮度为1，每张照片选取一个光亮度点，利用ACDsee5.0软件确定其坐标值。随机选取5个视野，计数CM-Dil阳性细胞数及细胞总数，计算标记率。标记率=视野内阳性细胞总数/视野内细胞总数×100%。

1.8大鼠心肌修复情况 取出大鼠心肌梗死组织，10%甲醛固定组织；梯度酒精脱水，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，随后进行浸蜡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5～8 μm薄片。将薄片烫平，再贴到载玻片上，45℃恒温烘干。脱蜡后，进行HE染色。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶干燥后，荧光显微镜下观察各组心肌梗死组织的病理学变化。于治疗后3 w和6 w，选取各个实验组5只大鼠麻醉处死，立即取出大鼠的心脏于液氮冻存30 min。随后取长轴垂直方向1～2 mm切片，以2，3，5-三苏基氨化四氮唑(TTC)染色法计算心肌梗死面积〔17〕。

1.9统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1EPCs形态观察 冷冻保存的EPCs复苏后重悬于新鲜的EPCs细胞培养液中，多数细胞生长良好。培养5～6 d发现细胞明显增殖即可传代，移植后2 w细胞呈平形排列或漩涡状集落生长，排列紧密；传代后的细胞传至第3代细胞生长迅速，纯度高、 形态单一(图1)。选取第3代细胞进入实验。

2.2大鼠心功能改变检测结果 在细胞移植和药物干预3 w及6 w后，与组Ⅰ相比，组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ心功能和左室收缩舒张功能明显改善(P<0.05)；组Ⅳ较组Ⅱ、Ⅲ显著提高了大鼠的心脏功能和左心室的舒缩能力(P<0.05)。见表1。

图1 第3代 EPCs的形态(×200)

组别移植后3 wLVAWd(cm)LVDs(cm)LVDd(cm)ESV(ml)EDV(ml)EF(%)FS(%)组Ⅰ0.14±0.020.53±0.110.63±0.120.32±0.210.56±0.2646.42±9.4323.21±6.17组Ⅱ0.11±0.021)0.48±0.101)0.66±0.081)0.25±0.201)0.70±0.251)65.72±8.241)32.71±6.421)组Ⅲ0.10±0.031)0.47±0.111)0.69±0.101)0.24±0.181)0.71±0.241)65.80±7.921)32.78±6.751)组Ⅳ0.08±0.021)2)3)0.37±0.081)2)3)0.72±0.111)2)3)0.16±0.091)2)3)0.87±0.221)2)3)75.89±4.661)2)3)42.75±7.351)2)3)组别移植后6 wLVAWd(cm)LVDs(cm)LVDd(cm)ESV(ml)EDV(ml)EF(%)FS(%)组Ⅰ0.15±0.030.57±0.090.65±0.140.31±0.160.58±0.2249.54±8.5625.12±6.23组Ⅱ0.13±0.031)0.52±0.081)0.68±0.121)0.25±0.171)0.72±0.231)69.45±9.052)35.65±7.061)组Ⅲ0.12±0.041)0.51±0.091)0.69±0.131)0.24±0.151)0.73±0.221)69.89±9.341)35.86±7.341)组Ⅳ0.10±0.031)2)3)0.41±0.061)2)3)0.74±0.121)2)3)0.17±0.161)2)3)0.85±0.221)2)3)77.25±8.441)2)3)47.34±7.661)2)3)

与组Ⅰ比较：1)P<0.05;与组Ⅱ比较：2)P<0.05;与组Ⅲ比较：3)P<0.05，下表同

2.3毛细血管密度的测定 与组Ⅰ相比，治疗3 w后组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均显著增加了心肌梗死组织中的新生毛细血管密度，组Ⅳ较组Ⅲ明显增高(P<0.05)。治疗6 w后，各组新生毛细血管密度均较治疗3 w后显著增加，而组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均显著高于组Ⅰ(P<0.05)，组Ⅳ效果最佳。见表2。

2.4VEGF基因和蛋白的表达 与组Ⅰ相比，治疗3 w后组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ心肌梗死组织中VEGF mRNA和蛋白相对表达水平均显著提高(P<0.05)，组Ⅳ显著高于其他组(P<0.05)。在治疗6 w后，各组心肌梗死组织中VEGF mRNA和蛋白相对表达水平较治疗3 w明显提高；组Ⅱ、Ⅲ VEGF mRNA和蛋白表达水平显著高于组Ⅰ(P<0.05)，而组Ⅳ明显高于组Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)。见表2和图2。

表2 各组新生毛细血管密度、心肌梗死组织VEGF mRNA和蛋白表达水平及心肌梗死面积

图2 各组VEGF mRNA和蛋白表达

2.5CM-Dil标记阳性EPCs 治疗3和6 w后，组Ⅱ和组Ⅰ未见CM-Dil标记阳性EPCs；组Ⅳ与组Ⅲ可观察到较多的CM-Dil标记阳性EPCs，组ⅣCM-Dil阳性EPCs明显多于组Ⅲ。见图3。

2.6心肌修复情况 在干预治疗3 w之后，组Ⅰ心肌组织发生了明显的组织病理学变化，如心肌梗死区域内肌纤维溶解、心肌肌组织发生断裂，心肌细胞排列紊乱；治疗各组心肌梗死组织形态学病变明显缓解，心肌组织区域正常，心肌细胞排列较为整齐，有明显的新生毛细血管存在；其中组Ⅳ心肌梗死状况明显好转，新生毛细血管最多，心肌细胞排列整齐度最佳(图4)。治疗3 w和6 w后，与组Ⅰ相比，组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的心肌梗死区域梗死面积显著降低,组Ⅳ低于其他各组。见表2。

图4 各组心肌修复情况(×200)

3 讨 论

在心肌缺血早期，往往出现心肌肥大和心肌胶原瘢痕，随之即发生心功能障碍，心肌舒缩能力下降和心肌坏死。EPCs是主要存在于机体骨髓中的干细胞亚群。在机体发生某种病理状况时，骨髓中的EPCs被动员进入外周血循环系统，开始向病理组织迁移。与其他干细胞特性相似，EPCs具有向组织缺血或者内皮损伤部位归巢的特性，并最终黏附、结合在受损血管部位。在EPCs迁移归巢过程中，VEGF等细胞因子发挥着重要作用。Miglionico等〔18〕通过对冠心病患者设置EPCs捕捉支架，取得了令人满意的治疗效果；这证明EPCs在心肌缺血性梗死部位的集聚对心肌梗死恢复具有重要作用。

国内外诸多研究已经表明，体外移植EPCs可显著提高心肌梗死动物的心脏功能，促进新生血管的形成〔19，20〕。其主要机制可能是：(1)EPCs分化为血管内皮细胞并直接形成新的血管，重新构建血液供应；(2)旁分泌VEGF等，保护心肌梗死部位的损伤细胞；(3)EPCs还可与宿主的细胞相互融合，增强缺血区域的心肌细胞功能。然而，Yao等〔21〕研究显示，体外移植的EPCs在宿主体内存活时间有限，因此这限制了EPCs移植效果。Schuh等〔22〕和Sen等〔23〕通过适当辅助性支持EPCs的移植，提高了EPCs的心肌梗死治疗效果，改善了心肌梗死后的心脏功能。远志皂苷元可促进血管内皮细胞的增殖并抑制内皮细胞的凋亡，据此推测其对于EPCs移植可能具有较好的辅助性支持效果。本研究结果显示，EPCs体外移植后，远志皂苷元明显提高了EPCs移植效率，增加了EPCs在心肌梗死组织的含量。这提示远志皂苷元还可通过提高EPCs在心肌梗死部位的存活率提高心肌梗死的治疗效果。VEGF在正常人心肌中含量较低，但在冠状动脉疾病中则表达水平急剧升高；只是VEGF的受体表达水平也随之提高，进而提高了内皮细胞增殖，放大了VEGF生物学效应〔24〕。VEGF可以促进血管内皮细胞的增殖，促进心肌血管的形成，增加血供〔24～26〕。此系因体外移植的EPCs及其分化而成的内皮细胞分泌增加所致。

综上，远志皂苷元干预提高了EPCs的移植效率，增加了EPCs在心肌梗死组织中的存留，进而促进心肌梗死恢复。远志皂苷元干预和EPCs移植的联合治疗提高了EPCs移植效率和治疗效果，其主要通过促进心脏功能恢复、缓解心肌组织病变、提高新生血管密度和VEGF的表达水平。远志皂苷元的干预对EPCs移植起到了明显的辅助支持作用，并为该细胞移植治疗心肌梗死开辟新的途径和思路，但其机制尚需要进一步探讨。