贾硕 孙艳 张颖宏 王宏竹 盛春华

(1中南大学湘雅二医院，湖南 长沙 410011；2解放军第208医院；3吉林大学第二医院)

肝癌具有发病隐匿、易转移复发及预后差等特征，患者生存期短，死亡率高，即使预后较好的小肝癌，术后也有超过70%的患者在2年内发生复发或远处转移，而高达90%以上的肝癌术后死亡因素与转移复发有关〔1〕。研究证实，肿瘤的发生、发展、治疗耐药和容易复发转移的根本原因在于患者体内存在肿瘤干细胞(CSCs)〔2〕。CSCs虽然数量很少，但很难杀灭，常规放化疗只能去除肿瘤组织中大多数增殖细胞，不能去除CSCs〔3〕。在杀灭大部分已分化的肿瘤细胞后(手术、放疗、化疗后)，再予以CSCs的靶向治疗，将可能是肿瘤治疗的新方案。肝癌手术后，残存在血液、淋巴循环及组织中的CSCs是复发和转移的根源〔4〕。CD133是目前比较明确的CSCs的表面标志〔5〕，本研究筛选CD133+CSCs，制备裸鼠肝癌模型，再以CSCs为靶点，体外诱导扩增树突细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，观察体内实验中CSCs抗原致敏的DC-CTL对肝癌的抑制作用，为CSCs的临床靶向治疗奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1主要材料试剂与仪器 GTT-551、DMEM细胞培养基、人AB血清(Gibco公司)；细胞因子白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ、IL-1α、IL-4、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(美国Peprotech公司)；抗人CD3单克隆抗体、CD8单克隆抗体、小鼠抗人单克隆抗体CD133-PE(美国BD公司)；ClinicMacs流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)，全自动磁性细胞分选仪(德国Miltenyi公司)。BABL/c雄性裸小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)15只，4～5周龄，体重18～20 g。

1.2，CSCs的分选 明确诊断肝细胞性肝癌患者手术后取肝癌组织，用生理盐水加入庆大霉素(100 U/ml)清洗，剪切组织块，加入胰蛋白酶液置于37℃孵箱中消化，并间断用搅拌棒搅拌，消化4 h，用200目滤筛过滤，重新制备成单细胞悬液，加生理盐水离心800 r/min 10 min，2次，应用高糖DMEM培养基加8%人AB血清接种于6孔板中，密度2×106/ml。严格应用磁珠分选系统说明书进行细胞分选操作。制备肝癌单细胞悬液，与CD133抗体磁珠进行交联后过分离柱进行分选，收集CD133+细胞，制备成CSCs单细胞悬液备用。

1.3流式细胞技术测定CSCs 取分选前的肝癌细胞悬液和分选后的CD133+细胞悬液，分别加入2 ml圆底离心管中，离心1 500 r/min，5 min，弃上清液。加入磷酸盐缓冲液(PBS) 1 ml离心洗涤1次，弃上清。调整细胞浓度，加入Fc受体封闭剂，4℃避光反应10 min。离心，弃上清液。用PBS 1 ml洗涤1次，离心。分别加入CD133-PE抗体，将上述2份细胞放在冰盒里避光孵育30 min，用1 ml含体积分数10%胎牛血清PBS洗涤2次，应用流式细胞仪分析测定CD133+细胞。

1.4CSCs和肝癌细胞抗原的获得 分别收集CSCs和肝癌细胞，用PBS调整密度为5×106/ml，细胞被反复冻融(-196～37℃)，循环4次。细胞裂解物经12 000 r/min离心5 min，取上清经滤器除菌后按Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书所示方法测量、计算抗原的蛋白浓度，分装后-70℃冻存备用。

1.5分别培养CSCs和肝癌细胞抗原致敏的DC-CTL

1.5.1外周血单个核细胞分别诱导扩增DC和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 肝癌患者(与上文获得肝癌干细胞为同一患者)手术1个月后，应用血液成分分离机进行单个核细胞单采，经Ficoll淋巴细胞分离液从单个核细胞分离淋巴细胞。用GTT-551培养基洗涤2次，用GTT-551培养基加入6%人AB血清混悬于培养瓶中，置37℃、5%CO2孵育箱中，2 h后将悬浮细胞移出进行CIK培养，贴壁细胞进行DC培养。

1.5.2CSCs和肝癌细胞抗原致敏的DC培养 贴壁细胞加入IL-4(500 U/ml)，GM-CSF(1 000 U/ml)培养，每隔2～3 d换液1次，第6天分别加入CSCs和肝癌细胞抗原100 μg/ml，第7天加入TNF-α(500 U/ml)诱导DC成熟，第9天分别收获成熟DC细胞。

1.5.3CIK培养 悬浮淋巴细胞加入重组人IFN-γ(1 000 U/ml)和10%AB型人血清的GTT-551培养液，24 h后更换成含100 ng/ml小鼠抗人CD3单克隆抗体、IL-1α(1 000 U/ml)和 IL-2(500 U/ml)的完全培养液继续培养，2 d后换含IL-2(500 U/ml)的完全培养液隔日换液维持培养9 d。

1.5.4分选CTL 参照ClincMacs使用说明，加入CD3、CD8抗体磁珠，应用CliniMacs流式细胞仪从诱导扩增的CIK中分选出CD3+CD8+T淋巴细胞。

1.5.5抗原致敏后的DC与CTL共培养，获得DC-CTL 细胞培养第9天，分别取CSCs和肝癌细胞抗原致敏后的DC，经活细胞计数后，按1∶5分别与CD3+CD8+T细胞混合培养，每2天加入IL-2(500 U/ml)半量换液，5 d后收集，获得分别CTL。细胞质量控制标准：细胞存活率≥95%，不含细菌、病毒和内毒素等微生物。

1.6检测抗原致敏的DC-CTL对裸鼠肝癌的抑瘤作用

1.6.1造模 将生长状态良好的人CSCs制备成为单细胞悬液，以1×106/只，注射到BABL/c裸小鼠右侧腋下，每天观察小鼠的饮食及精神状态，8 d后可见小鼠右侧腋下长出肿瘤，成瘤率为100%。

1.6.2分组实验 将无差异造模成功裸鼠随机分为3组，每组5只：生理盐水对照组，CSCs抗原致敏组，肝癌细胞抗原致敏组。3组分别给予尾静脉注射：生理盐水、CSCs抗原致敏的DC-CTL、肝癌细胞抗原致敏的DC-CTL。每次1×108/0.5 ml。每3 d治疗1次，治疗5次，末次治疗2 w后处死裸鼠，剥出瘤块，用电子天平称取瘤重，计算抑瘤率。

1.6.3计算抑瘤率 抑瘤率(%)=(对照组平均肿瘤重量-实验组平均肿瘤重量)/对照组平均肿瘤重量×100%。

1.7统计学方法 应用SPSS13.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1流式细胞技术测定CSCs CD133表达达到98.4%，说明分选成功，得到的细胞基本为具有CD133+标志的CSCs。

2.2抗原致敏DC培养 DC培养至第9天在显微镜下观察，DC呈圆形，贴壁生长，表面有树突状突起。应用流式细胞技术测定DC表面标志，说明为成熟DC。

2.3CIK培养 流式细胞术测定细胞诱导扩增前CD3+CD8+细胞含量约为48%，细胞诱导扩增9 d，CIK中CD3+CD8+含量约达90%，并且细胞总数量随诱导时间大幅扩增，第1天CIK数量为(1.05±0.05)×106/ml，第7天CIK数量为(56.33±1.85)×106/ml，第9天CIK数量为(112.19±2.17)×106/ml，第9天扩增100余倍。

2.4动物实验结果 与生理盐水对照组相比，无论是肝癌细胞抗原致敏组还是肝癌CSCs抗原致敏组对肿瘤都具有极显著的抑制作用(P<0.01)，CSCs抗原致敏组较肝癌细胞抗原致敏组抑瘤率显著增高(P<0.05)，见表1，说明CSCs抗原致敏的DC-CTL对肝癌具有更强的抑制作用。见图1，表1。

图1 抗原致敏的DC-CTL对裸鼠肝癌的抑制作用

组别瘤重量(g)抑瘤率(%)生理盐水对照组6.918±1.6070.00肝癌细胞抗原致敏组3.679±1.05654.241)CSCs抗原致敏组2.502±0.83365.081)2)

与生理盐水对照组比较：1)P<0.01；与肝癌细胞抗原致敏组比较：2)P<0.05

3 讨 论

近年来随着CSCs生物学研究的深入，CSCs揭示了肝癌的发生发展，普遍认为CSCs是肝癌的种子细胞，在肝癌的增殖、转移等多种重要生物学过程中具有决定性作用。对CSCs进行有效抑制，可能是肝癌治疗的关键〔6，7〕。研究认为，CSCs对放化疗耐药，术后复发转移是患者最终死亡的主要原因，而CSCs逃脱免疫系统监视清除是复发转移的根源。人体抗肿瘤免疫主要为细胞免疫，介导细胞免疫的主要是T淋巴细胞和NK细胞。在T淋巴细胞介导的细胞免疫中CD3+CD8+细胞即效应细胞毒性T细胞主要发挥识别和杀伤肿瘤细胞的作用。肝癌患者往往细胞免疫功能低下，肿瘤免疫原性差，不能有效提呈给DC细胞，机体难以产生针对性的CD3+CD8+T细胞。CD133是CSCs明确的表面标志。本研究根据CD133分子标志从肝癌组织中筛选人CSCs，进一步获得CSCs抗原。从病人外周血中分离单个核细胞，分别诱导和扩增人CSCs抗原致敏的DC和CIK。以CSCs为靶标，通过MTT实验观察其靶向性杀伤CSCs的作用。DC是人体内功能最强大的抗原呈递细胞，能有效激活初始T细胞，诱导出抗原特异性CTL，使机体产生抗肿瘤免疫反应。抗原致敏后DC的增殖活性和对抗原的识别作用均增强〔8〕。CIK是人体外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子诱导而获得的一种异质性T细胞〔9〕，增殖能力强，短期培养后即可达到抗肿瘤效应细胞的数量。CIK对肿瘤细胞的毒性是非主要组织相容性(MHC)限制的，并且对一般的肿瘤干细胞也具有细胞毒性〔10〕。它通过释放细胞颗粒、激活肿瘤细胞凋亡基因、活化死亡受体caspase级联反应、分泌多种细胞因子抑制肿瘤细胞、间接调节免疫功能等机制，发挥其对肿瘤细胞广谱、高效的杀伤作用。CIK富含大量CTL。通过临床应用级别的ClinicMacs流式细胞仪分选出CD3+CD8+的CTL细胞与DC共培养后，细胞间的相互作用能促进二者的成熟和增殖，增加DC和共刺激分子递呈抗原的特异性，促进DC分泌IL-2〔12〕。本研究结果显示，DC-CTL对肝癌细胞具有直接的杀伤作用。CSCs抗原致敏的DC-CTL对CSCs可能产生了靶向性的识别和杀伤作用，对于临床患者手术后进行CSCs的清除治疗具有一定参考意义。