苏振宇 黄建成 董彦博 李小兵 张会军

(河北医科大学第一医院心外科，河北 石家庄 050031)

心肌缺血再灌注后损伤的具体发病机制还不明确，是多种因素相互作用的结果〔1，2〕。减少心肌细胞内钙超载是防治再灌注损伤的重要环节，Ca2+也是调节心肌细胞收缩和舒张所必需的因素，心肌细胞内游离钙浓度〔(Ca2+)i〕维持在一定范围方能保证心肌正常功能〔3〕。成熟心肌〔(Ca2+)i〕主要靠肌浆网的释放与隔离作用来调节。而未成熟心肌的肌浆网稀疏、质膜面积和细胞容积比值大，钙泵活性低〔4，5〕。为此在心肌缺血再灌注后中使用钙通道阻断剂使细胞外钙内流减少，可减轻细胞内钙超载，对心肌有保护作用〔6，7〕。钙激活氯通道(CaCCS)在组织中分布广泛，包括血细胞、上皮细胞、内皮细胞中，可参与腺体和上皮分泌、感觉传导、细胞增殖、神经和心肌兴奋性调节、细胞分裂周期等〔8，9〕。跨膜蛋白(TMEM)16A为钙激活氯通道的分子基础，在肿瘤组织中明显表达上调〔10，11〕，但是对心肌酶的影响还无相关报道。本文探讨TMEM16A氯通道对心肌缺血再灌注后损伤大鼠乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的影响。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 出生1～3 d的SD大鼠20只，由河北医科大学第一医院动物实验中心提供。MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司，辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG购自华美生物工程有限公司，羊抗兔一抗〔蛋白激酶B(Akt)、β-actin等〕购自Cell Signaling公司，LDH和CK-MB检测试剂盒购自Sigma公司。

1.2心肌细胞分离与培养 SD大鼠消毒，开胸取出心脏，放入预冷无菌的D-Hank液中，用无菌剪刀剪开心脏，采用D-Hank液冲洗血液。再采用无菌剪刀将心室肌剪成1 mm3大小的组织块，加入胰蛋白酶消化5～10 min，取上层混悬液。继续加入新鲜的胰蛋白酶10 ml消化5～10 min，移弃上清。加入含15%胎牛血清的MEM培养基10 ml，4℃下离心(1 000 r/min，离心半径10 cm)，过200目孔径不锈钢进行网筛。心肌细胞培养鉴定标准：倒置显微镜下细胞呈放射状，细胞核呈椭圆形，细胞呈片状有节律搏动。

1.3实验分组 心肌细胞分为4组，A组：阴性对照组：于常氧条件下培养心肌细胞3 h；B组：阳性对照组：灌注组，心肌细胞未经任何处理，采用缺氧2 h、复氧1 h进行心肌缺血再灌注处理。C组：激活组，采用TMEM16A氯通道激活剂1 mmol/L预处理20 min，再进行心肌缺血再灌注处理；D组：抑制组，采用TMEM16A氯通道抑制剂1 mmol/L预处理20 min，再进行心肌缺血再灌注处理。

1.4检测指标 (1)细胞活性测定：将心肌细胞接种于96孔培养板，吸弃培养基，每孔加入5 mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)20 μl，培养4 h后弃MTT液，每孔加入二甲基亚砜100 μl，震荡20 min后，选择结晶紫溶解后，于490 nm下检测吸光度值，计算细胞活性。(2)活性氧(ROS)水平测定：心肌细胞接种于6孔板，加入100 μl终浓度为10 μmol/L的二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-CA)覆盖细胞，然后与DCFH-CA探针混合，37℃度培养30 min，PBS洗涤3次，采用流式细胞仪检测细胞内的荧光强度，检测波长520 nm，荧光强度与细胞内产生的ROS量呈正比。(3)Western印迹法：分析活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)-3、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt的表达水平，实验结束后，倒掉培养液，PBS洗涤细胞2次，取细胞，至EP管中，离心(12 000 r/min，4℃)5 min，将上清转移至另一EP管中作为蛋白原样，进行Western印迹分析。读取目的条带的光密度扫描值，以β-actin条带作为内标，取相对表达量。(4)CK-MB活性、LDH活性测定：CK-MB活性(U/ml)=〔7.449 1×(测定OD-测定空白OD)-0.071 6〕×样本测试前稀释倍数。LDH活性(U/L)=(OD测定管-OD对照管)/(OD标准管-OD空白管)/50%×反应液的总体积，所有实验重复3次。

1.5统计方法 采用SPSS22.00软件行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1心肌细胞特性 心肌细胞刚接种后细胞呈球形悬浮在培养液中；培养4～6 h后开始贴壁生长；培养12～24 h细胞基本贴壁，自发性搏动频率为(40～80)次/min；培养2 d后细胞收缩明显而有力，同步节律性搏动频率为(90～120)次/min。

2.2细胞存活率、CK-MB与LDH活性对比 实验前各组细胞存活率均在95%以上，实验结束后A、B、C、D组的细胞存活率对比差异有统计学意义(P<0.05)。B、C、D组的CK-MB与LDH活性都高于A组(P<0.05)，D组的CK-MB与LDH活性低于B组、C组(P<0.05)。见表1。

表1 4组细胞存活率、CK-MB与LDH 活性对比

与A组对比：1)P<0.05；与B组对比：2)P<0.05；与C组对比：3)P<0.05，下表同

2.3ROS水平对比 B、C组的ROS水平(121.43±18.4、188.93±32.91)显著高于A组(20.48±3.20，P<0.05)，D组的ROS水平(43.20±2.22)与B、C组相比显著减少(P<0.05)，但是与A组相比依然有统计学差异(P<0.05)。

2.4cleaved caspase-3、p-Akt、Akt表达对比 B、C组的cleaved caspase-3、p-Akt相对表达水平高于A组(P<0.05)，D组与A组相比差异无统计学意义(P>0.05)，4组Akt相对表达水平对比差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表2。

图1 各组细胞cleaved caspase-3、p-Akt、Akt表达

组别cleaved caspase-3p-AktAktAkt/p-AktA组0.45±0.140.10±0.040.78±0.217.84±2.42B组0.63±0.121)0.37±0.121)0.76±0.172.19±0.421)C组0.78±0.311)2)0.58±0.141)2)0.78±0.191.45±0.321)2)D组0.53±0.082)3)0.08±0.032)3)0.77±0.5310.87±3.222)3)F值4.78311.5210.2318.142P值<0.05<0.05>0.05<0.05

3 讨 论

从机制上分析，心肌缺血时，心肌得不到氧及底物供应，可造成心肌形态结构、功能的急剧变化，为此需要迅速恢复缺血组织的血供，但是长时间缺血的心肌恢复灌流时组织损伤及器官功能障碍反而加重〔12，13〕。已有研究表明心肌缺血再灌注后损伤与氧自由基、血管无复流、钙超载、白细胞等多种因素，也不是单一因素造成的，而是许多环节共同作用的结果〔14〕。

基础研究表明TMEM16A沉默能引起内源性CaCCs功能的抑制，表达异源的TMEM16A有CaCCs生理和药理学特征，独立构成了CaCCs或与其他未知蛋白共同构成了CaCCs〔15〕。TMEM16A氯通道在正常情况基本处于关闭状态，当细胞缺氧、三磷酸腺苷(ATP)减少时促进氯通道开放，TMEM16A氯通道开放可以发挥加重心肌缺血再灌注损伤的作用，阻断TMEM16A氯通道则心肌缺血预适应的保护作用恢复〔16〕。有研究表明TMEM16A氯通道属于终末效应器〔17〕，但有学者认为TMEM16A氯通道是启动因子〔18〕。心肌缺血再灌注时，大量的ROS呈现爆发性生成，从而造成ROS在体内积聚。ROS可以使大量的白细胞在心肌毛细血管聚集并活化，增强中性粒细胞的趋化性，引起心肌微血管的阻塞。TMEM16A氯通道抑制剂可有利于降低ROS活动，对心肌缺血再灌注后损伤有良好的防治作用〔19，20〕。

心肌缺血再灌注后损伤后，多种内源性物质释放，如降钙素基因相关肽、内皮素、内啡肽等通过相应信号转导，引起离子通道改变，但是具体机制还不明确。最近研究表明TMEM16A氯通道对心肌产生保护作用，已在培养的大鼠及人心房心肌细胞得到证实〔21〕。LDH和CK-MB为反映心肌功能的常见指标，在诊断再灌注后损伤时有一定价值〔22〕。LDH和CK-MB高表达可直接损伤血管内皮细胞，使其通透性增高，破坏血凝-抗血凝平衡，促进血栓形成〔23〕。LDH和CK-MB还可刺激血管平滑肌细胞向血管内皮下浸润、聚集和增生，使血管平滑肌细胞收缩较弱，肌动蛋白合成减少，从而促进动脉粥样硬化形成〔24〕。基础研究表明CaCCs可激活导致膜去极化或复极化，钙调蛋白的敏感性异常，使钙通道磷酸化时间延长，导致蛋白磷酸酶活性显著下降，导致钙内流增加，也诱导了TMEM16A氯通道开放〔25〕。TMEM16A氯通道抑制剂可抑制电位依赖的Ca2+内流，扩张全身阻力血管和容量血管，从而抑制CK-MB与LDH活性，舒张小冠状动脉和阻力血管，增加冠状动脉血流，降低心脏前后负荷和心肌耗氧量。

心肌缺血再灌注后损伤的调节过程涉及多条细胞内外信号转导通路〔26〕。活化的cleaved caspase-3被上游的凋亡始动子激活后可以作用于特异性底物，可诱导细胞凋亡。cleaved caspase-3激活后与可裂解一系列细胞内骨架蛋白及细胞修复酶等，改变细胞结构，激活核酸内切酶将染色质切割，使细胞骨架蛋白、细胞外基质蛋白降解，裂解或失活DNA修复相关分子〔27〕。本研究表明TMEM16A氯通道抑制剂可通过降低cleaved caspase-3、p-Akt水平从而对再灌注后心肌损伤起到保护作用。也有研究表明TMEM16A氯通道关闭能导致细胞膜超级化和动作电位时间缩短与钙内流降低有关，并能保护心肌于缺血时钙超载所致的不可逆损害〔28〕。