赵 佩，刘志龙，高进贤，石 磊，于 静，葛 斌，袁继勇

(甘肃省人民医院1.药剂科、2.麻醉科，甘肃 兰州 730000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性复发性溃疡，临床表现出慢性复发性、持续性及难治性的特点，病因及病理机制尚不十分明确。大量研究表明，肠腔内各种抗原发生易位，并暴露于黏膜固有层的免疫系统，引起促炎细胞因子水平升高，抗炎细胞因子水平下降，导致级联的免疫炎症反应与UC有关[1]。目前,针对UC的治疗药物主要包括抗炎药、皮质类固醇、生物制剂、免疫调节剂等，但长期使用可产生腹泻、腹部疼痛不适等不良反应[2]，且这些治疗方法并非对所有的UC患者均有效[3]。因此，治疗UC的药物开发依旧是研究热点。铁皮石斛为兰科石斛属草本植物，具有滋阴清热、生津宜胃、润肺止咳等功效，现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗炎、增强机体免疫功能、抗氧化、降血糖等广泛的药理作用[4]。本研究以铁皮石斛的抗炎及调节免疫作为切入点，通过检测铁皮石斛对UC小鼠炎性反应相关蛋白的影响，初次探讨铁皮石斛对UC小鼠的治疗效应和作用机制，为进一步深入研究传统中药铁皮石斛的药用价值提供依据。

1 材料

1.1实验动物健康SPF级BALB/c小鼠，♂，体质量18～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号:SCXK(京)2016-0011。

1.2药品与试剂铁皮石斛购于上海第一制药公司(批号:170122);5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)购于上海爱的发制药有限公司(批号:160209)；葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS),分子质量为36 000～50 000，美国MP Biomedicals公司产品；γ-干扰素(interferon γ，INF-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)试剂盒，购于美国R&D公司(批号为E2000-1711-1、E2720-1710-3)；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗体购自英国Abcam公司(货号：ab31419)。

1.3仪器Eyela N-1100旋转蒸发仪(日本Rikakikai有限公司)；Labofuge400R低温离心机(德国Heraeus公司)；实时定量PCR仪、电泳仪(美国Bio-Rad公司)； UV-5600紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；MR-96A酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

2 方法

2.1铁皮石斛提取物的制备根据文献报道[5-6]，将铁皮石斛在-80 ℃冷冻干燥成粉末，添加20倍质量体积的甲醇，不断搅拌过夜提取两次。用旋转蒸发仪蒸发甲醇，并浓缩干燥提取物，最终得铁皮石斛提取物浸膏粉末。

2.2模型的制备及给药BALB/c ♂小鼠60只随机分为6组，分别为正常组、DSS模型组、5-ASA(100 mg·kg-1)对照组、铁皮石斛低、中、高剂量组(200、400、800 mg·kg-1)，每组10只，治疗药物剂量参考文献报道[5-6]。适应性饲养1周，观察无异常表现后再进行实验,实验前1 d，每组小鼠禁食不禁水24 h。参考文献的造模方法，正常组自由饮用蒸馏水，其余各组自由饮用4% DSS溶液，连续7 d，诱导UC模型，d 8开始全部换成蒸馏水。造模d 1开始灌胃给药，除正常组与模型组给予蒸馏水外，其余各组以0.02 mL·g-1体质量给予相应药物，连续给药10 d[7]。

2.3标本采集及处理末次给药后，小鼠禁食24 h后眼眶取血，以3 000 r·min-1离心15 min,分离血清，置-20 ℃冰箱保存。取血完毕后处死小鼠，采集小鼠结肠组织，称重并测量长度，沿肠系膜缘剪开肠腔，用生理盐水冲洗肠内容物，剪成2段，中性甲醛溶液内固定，石蜡包埋进行常规病理切片、HE染色及免疫组化染色。

2.4指标检测及方法

2.4.1外观指标 造模前后及给药后，观察小鼠的精神及活动情况，记录体质量。按照Tab 1的标准，每天计算各组小鼠疾病活动指数 (disease activity index，DAI)评分[8]。DAI=(体质量下降分数+腹泻分数+便血分数)/3。

Tab 1 Criteria for disease activity index

a正常：成形大便；松散：不黏附于肛门的糊状、半成形大便；腹泻：可黏附于肛门的稀水样便。

2.4.2病理学指标 HE染色的病理组织切片，按照周毅骏等[9]的标准进行评分，评分标准见Tab 2。

2.4.3血清中细胞因子测定 ELISA法测定各组小鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量。取提前分离并冷冻保存的血清，放置室温，严格按照IFN-γ、TNF-α检测试剂盒说明操作。

2.4.4Real-time PCR测定小鼠远端结肠中IFN-γ、TNF-α mRNA的表达 剪取小鼠远端结肠组织约50 mg，用PBS冲洗，剪碎组织，加入500 μL TRIzol,研磨匀浆提总RNA,核酸微量定量仪检测RNA纯度及浓度后，应用反转录试剂盒(GoScriptTMReverse Tanscription System)将RNA反转录成cDNA，后用GoTaq qPCR Master Mix试剂盒进行荧光实时定量PCR反应。IFN-γ、TNF-α和内参β-actin的引物由上海生工生物工程有限公司设计、合成，引物序列见Tab 3。PCR的参数为:95 ℃预变性1 min，(95 ℃,10 s；60 ℃,20 s；72 ℃,20 s收集荧光)，共40个循环。实验结果自动以Ct值给出。相对表达量按照2-ΔΔCt方法进行计算。反应完毕后，65～95 ℃,0.5 ℃·s-1将扩增的PCR产物做熔解曲线分析。

Tab 2 Criteria for assessment of microscopic colon damage

Tab 3 Primer sequence

2.4.5Western blot检测结肠组织中MPO的表达 剪取小鼠结肠组织约50 mg，用PBS冲洗，剪碎并加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液500 μL,研磨匀浆提取蛋白,经BCA定量蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳,蛋白转印至活化的PVDF膜上,5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，MPO抗体(1 ∶500)4 ℃孵育过夜, TBST洗涤3遍,每遍10 min,加入二抗(1 ∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗涤3遍,每遍10 min，滴加ECL进行化学曝光，显影、冲洗胶片并扫描分析，对目的条带做灰度分析，以目的蛋白的灰度值比内参GAPDH的灰度值校正误差，比较蛋白表达情况。

3 结果

3.1铁皮石斛提取物对UC小鼠体质量、结肠长度的影响与对照组相比，模型组小鼠在造模d 2出现皮毛无光泽、食量减少和体质量减少的症状，d 3即出现不同程度的腹泻、血便，这些症状此后不同程度加重。5-ASA和铁皮石斛提取物治疗组小鼠上述症状较模型对照组减轻，体质量减轻趋势较缓和，且铁皮石斛提取物800 mg·kg-1治疗组体质量变化与模型对照组差异有显著性(P<0.05)，见Fig 1A。处死小鼠后测量小鼠结肠长度(Fig 1B),模型对照组小鼠结肠变短，与正常对照组小鼠相比差异有显著性(P<0.05)，而5-ASA和铁皮石斛提取物不同剂量组小鼠结肠均较模型对照组长(P<0.05)。

Fig 1 Effects of D.officinale on body weight(A) and colon length(B) of ulcerative colitis

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.2DAI和病理学指标评估实验过程中，对照组小鼠精神较好，食量、活动均无异常，皮毛有光泽，大便未出现血样物。模型组小鼠在造模d 3后出现活动度下降，进食减少，部分小鼠出现稀便甚至腹泻，肛周污秽黏腻，更严重的出现黏液脓血便，模型组小鼠DAI评分较正常对照组明显升高(P<0.01)；铁皮石斛提取物200、400 mg·kg-1组的小鼠给药后较模型组一般情况有好转，食量、活动量均改善，但个别小鼠有腹泻，伴有体质量减轻，DAI评分与模型组比较降低(P<0.05)；铁皮石斛提取物800 mg·kg-1组和5-ASA灌胃5 d后，小鼠活动情况较模型组好转，偶有小鼠大便松散，体质量有所恢复，DAI评分较模型组明显降低(P<0.01)，见Tab 4。

Fig 2、Tab 4结果显示，镜下观察小鼠结肠组织，与正常小鼠结肠黏膜相比，模型组小鼠结肠黏膜有炎症, 肠管增粗，黏膜层及浆肌层有大量中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润, 个别黏膜层明显变薄。铁皮石斛提取物高剂量组及5-ASA组镜下小鼠结肠黏膜炎性浸润、肌层病变较模型组有明显减轻，组织学损伤评分与模型组相比差异有显著性(P<0.01)；铁皮石斛提取物低、中剂量组与模型组小鼠相比，肠壁与周围组织有较轻组织黏连，隐窝结构基本完整，仍有部分炎性细胞浸润，组织学损伤评分较模型组小鼠差异性较小(P<0.05)。

Fig 2 Effects of D.officinale on colon tissue damage of rats(HE, ×100)

A:Normal group;B: Model group; C:5-ASA group;D:D.officinale200 mg·kg-1group; E:D.officinale400 mg·kg-1group;F:D.officinale800 mg·kg-1group.

Tab 4 Scores of disease activity

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.3铁皮石斛提取物对小鼠血清IFN-γ、TNF-α含量的影响如Tab 5所示，正常对照组小鼠血清中IFN-γ、TNF-α的含量均较低，而模型组小鼠血清IFN-γ、TNF-α含量明显增多(P<0.01，P<0.05)；5-ASA和铁皮石斛提取物各剂量干预后，小鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量均下降，IFN-γ含量减少明显，与模型组相比，5-ASA和铁皮石斛提取物中、高剂量组明显降低血清IFN-γ含量(P<0.05)。TNF-α含量经阳性药物治疗后虽有下降，与模型组小鼠相比，无统计学差异，其与铁皮石斛提取物也未表现出剂量依赖性，400 mg·kg-1的铁皮石斛提取物明显降低血清TNF-α含量(P<0.05)。

Tab 5 Effects of D.officinale on concentrations of IFN-γ, TNF-α after oral administration in UC

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.4铁皮石斛提取物对小鼠远端结肠组织中IFN-γ、TNF-αmRNA表达的影响如Fig 3所示，经过DSS诱导的UC小鼠远端结肠组织中IFN-γ、TNF- α mRNA的表达明显高于正常小鼠(P<0.05)；经过铁皮石斛提取物的干预治疗，IFN-γ、TNF-α mRNA的表达呈下降趋势，其中，IFN-γ mRNA表达下降与铁皮石斛剂量有相关性，中、高剂量效果明显(P<0.05)。而阳性药物与铁皮石斛提取物能够抑制TNF-α mRNA的表达，但数据统计差异无显著性。表明铁皮石斛能有效抑制UC小鼠结肠组织中促炎因子IFN-γ mRNA的表达，减轻结肠炎症反应。

Fig 3 Expression of IFN-γ, TNF-α mRNA by quantitative real-time n=10)

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.5铁皮石斛提取物对小鼠结肠组织中MPO表达的影响如Fig 4所示，与正常组相比，模型组小鼠结肠组织中MPO蛋白表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比，5-ASA和铁皮石斛干预各组，UC小鼠结肠组织中MPO蛋白表达明显降低(P<0.05)，但并未呈现剂量相关性，中剂量的铁皮石斛降低MPO蛋白表达效果较优。

Fig 4 Protein expressions of MPO in colon

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

4 讨论

近年来，UC在全球的患病率呈持续上升的趋势。尽管UC的病因和病理生理学尚不完全清楚，异常免疫反应在UC的发展中起着至关重要的作用[10]，它激活了结肠炎发病的标志物活性氧/氮物质(reactive oxygen species/reactive nitrogen species，ROS/RNS)生成系统，黏膜促炎性细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2等)过度产生，炎症反应逐级放大，促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡失调，导致了结肠组织的损伤。

化学诱导剂DSS诱导的小鼠UC模型在临床症状、组织学和微观方面与人类UC相似，具有很好的结肠损伤及肠上皮屏障破坏的发病特征，适合筛选UC及炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)潜在治疗药物[11]。我们以铁皮石斛为目标药物，它主要有效成分是石斛多糖、石斛碱等，有报道铁皮石斛具有抗炎、增强机体免疫功能的药理活性，可促进机体内外抗炎细胞因子的产生，并发挥调节免疫的作用[12]。结合铁皮石斛的药理活性和UC发病的异常免疫特点，本实验考察铁皮石斛提取物对UC小鼠的治疗作用。

实验研究显示，铁皮石斛提取物低、中、高剂量组对于UC临床症状和肠道黏膜层显示出了较好的保护和修复作用，腹泻程度、疾病活动指数、黏膜充血水肿程度、中性粒细胞及炎性细胞浸润、隐窝破坏程度均降低，提示铁皮石斛提取物能降低炎症的严重程度和范围。在促炎因子中，IFN-γ、TNF-α是UC发病机制中的研究热点，IFN-γ由NK细胞和Th1淋巴细胞产生，是典型的促炎因子，免疫调节活性强。而TNF-α作为肿瘤坏死因子家族的核心成员，是IBD中重要的调节因子，也是肠道上皮细胞增殖和凋亡的主要促炎因子，它也能激活中性粒细胞，诱导白三烯B4、O2、血小板激活因子等，导致UC患者肠黏膜微循环障碍。另外，TNF-α可增加粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、内皮细胞MHC1类抗原、IL-1、IL-8的分泌，并促进中性粒细胞黏附内皮细胞，刺激局部炎症反应。本研究结果表明，模型组中，血清促炎因子IFN-γ、TNF-α的表达明显增高，与Abdin等[13]的报道一致，其表达与DAI和病理学组织评估结果相一致。且在基因表达水平，模型组TNF-α、IFN-γ mRNA表达明显高于正常小鼠，经过铁皮石斛提取物的干预治疗，表达明显下降，治疗作用呈现剂量-效应关系。MPO是组织损伤和中性粒细胞浸润的标志，先前的研究[14-15]已经证实，MPO的表达增高与中性粒细胞在肠上皮隐窝内和肠黏膜层内累积、浸润所导致的结肠上皮损伤密切相关。本实验结果中，铁皮石斛提取物各剂量组结肠组织中MPO含量明显低于模型组，说明铁皮石斛能减轻中性粒细胞浸润，改善结肠炎症程度，起到黏膜保护作用。铁皮石斛提取物对UC小鼠血清和结肠组织中IFN-γ、TNF-α、MPO表达的调控提示，其机制可能与下调促炎因子有关，且TNF-α能启动NF-κB介导的反应，是其有效激活物，因此，也可考虑涉及了抑制NF-κB信号通路。

总之，本研究在动物实验中初步证实了铁皮石斛提取物对DSS诱导的UC的治疗作用，其可能的机制为减少血清促炎因子IFN-γ、TNF-α的释放，下调促炎因子IFN-γ、TNF-α、MPO的表达，阻断炎症的放大效应。关于铁皮石斛治疗UC的作用机制有待进一步深入研究。

(致谢：本实验主要在兰州大学第二医院药学部实验室及甘肃省人民医院科研中心完成，感谢课题组成员在整个实验中所付出的劳动。)