李静，郑雪，丁新，向辉，陈卫刚

肝脏疾病是我国常见病、多发病，肝硬化和肝癌是肝脏疾病重要的致死原因。肝纤维化是肝硬化和肝癌的中间环节，而抑制肝星状细胞的激活和增殖是缓解肝纤维化的策略之一。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓中的非造血组织，因具有自我更新、多向分化、免疫抑制等功能而成为临床研究热点［1］。现越来越多的动物实验及临床试验表明BMSCs可治疗骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、脊髓损伤［2］。近年来，BMSCs在肝纤维化方面的治疗也取得了一定的进展［3］，但其具体机制还不明确。本实验将骨髓间充质干细胞与肝星状细胞（HSCs）建立间接共培养体系，初步探讨骨髓间充质干细胞缓解肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SD雄性大鼠，体质量120～180 g，购自新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心；大鼠肝星状细胞（上海富衡生物科技有限公司）；胎牛血清（美国BI公司）、L-DMEM培养基（美国Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司），CD29-FITC抗体、CD45-FITC抗体、CD90-PE抗体（eBioscience公司）；MTT（Solarbio公司）；肝细胞生长因子ELISA试剂盒（中国Elabscience公司）；c-met抗体（MCE公司）；兔抗α-肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体（ab32575，Abcam公司）；荧光二抗（山羊抗兔IgG-FITC，北京中杉金桥生物科技有限公司）；PI（美国Sigma公司）；Transwell insert半透膜（0.4µm，美国Corning Costar公司）；Annexin V-PE细胞凋亡试剂盒（中国联科生物公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（美国BIO-RAD公司）；激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的提取、培养和鉴定 利用全骨髓贴壁培养法提取大鼠双下肢骨髓间充质干细胞，收集第2代对数生长期细胞，流式鉴定表面分子CD29、CD90、CD45；复苏新购的HSCs，取第3代生长活跃的细胞，倒置相差显微镜下观察活体细胞形态学改变，采用荧光免疫法检测α-SMA的表达。

1.2.2 细胞共培养体系的建立及实验分组 6孔板半透膜（直径0.4µm）上层每孔接种1×105个细胞，下层接种5×104个细胞/孔。实验分组：（1）H组，HSCs单独培养（半透膜上层只有培养基）。（2）H-H组，HSCs和HSCs共培养。（3）M-H组，BMSCs与HSCs共培养。（4）M-H-C组，c-met抑制剂2 mmol/L预先封闭HSCs表面肝细胞生长因子（HGF）受体，4 h后BMSCs与HSCs共培养；48 h后倒置相差显微镜下动态观察活体细胞形态学改变。

1.2.3 MTT法检测HSCs增殖抑制率 各组细胞共培养48 h后，抽取上清液保留备用，0.25%胰酶消化贴壁细胞，用各组共培养上清液分别重悬各组细胞，以3 000个细胞/孔均匀接种在96孔板上，孵育4 h，向各孔加10µL MTT液，4 h后弃上清，各孔加100µL二甲基亚砜（DMSO），在酶标仪上测定各孔在450 nm处的光密度（OD）值；细胞生长抑制率=（H组平均OD值-各处理组平均OD值）/H组平均OD值×100%。

1.2.4 共聚焦显微镜检测HSCs中α-SMA的表达 各组细胞共培养48 h后，弃上清，4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.2%Triton-X-100透膜3 min，5%BSA封闭，孵α-SMA抗体，4℃过夜，次日暗室加荧光二抗，37℃孵育1～2 h，PI染核1 min，PBS洗4次，抗荧光淬灭剂封片，即刻采用激光共聚焦显微镜观察。

1.2.5 流式细胞仪检测HSCs凋亡率 各组细胞共培养48 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集各组HSCs并计数，按照Annexin V-PE/7-ADD细胞凋亡试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 ELISA检测共培养上清液HGF浓度 各孔中加入不同浓度的标准品或上下两层共培养上清液，按照肝细胞生长因子ELISA试剂盒说明书严格操作，用酶标仪在450 nm波长处测量各孔OD值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘制四参数逻辑函数的标准曲线，根据标准曲线计算各组细胞上清液中HGF浓度。

1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，所有计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态特征及鉴定情况 原代BMSCs以集落为中心呈放射状向周围生长，培养至5～7 d时，细胞呈现明显的旋涡状。BMSCs流式鉴定结果显示，99.3%的细胞表达CD29，98.9%的细胞表达CD90，0.8%的细胞表达CD45，表明提取的原代细胞为纯化的BMSCs。HSCs在倒置显微镜下呈星形或多边形伸展状态，共聚焦结果显示活化后的HSCs胞膜及胞浆表达α-SMA，符合实验要求，见图1。

2.2 BMSCs抑制肝星状细胞的增殖 各组细胞共培养48 h后显示，BMSCs对HSCs的增殖抑制率最大，HSCs对HSCs的增殖抑制率次之，M-H-C组几乎无抑制，M-H组与H-H组、M-H-C组相比均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

Tab.1 Effects of BMSCs on HSCs after 48-hour co-culture表1 共培养48 h后BMSCs对HSCs的影响 （±s）

Tab.1 Effects of BMSCs on HSCs after 48-hour co-culture表1 共培养48 h后BMSCs对HSCs的影响 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与H组比较，b与H-H组比较，c与M-H组比较，P＜0.05

组别H组H-H组M-H组M-H-C组F增殖抑制率（%，n=3）-13.46±5.75 25.41±0.89b 0.62±0.82bc 40.085＊＊α-SMA荧光强度（n=5）117.50±6.25 108.98±7.22 11.83±1.72ab 124.29±6.75c 401.170＊＊凋亡率（%，n=3）6.30±3.72 6.30±0.70 14.07±3.85ab 6.57±0.71c 5.963＊HGF浓度（ng/L，n=3）14.22±0.78 16.59±3.61 42.88±4.53ab 15.58±0.80c 65.006＊＊

2.3 BMSCs抑制HSCs的活性 与M-H组比较，其余3组HSCs胞膜和胞浆α-SMA表达量均增高，差异有统计学意义（P＜0.005），而其余3组间比较差异无统计学意义，见表1、图1。

Fig.1 α-SMA expression of hepatic stellate cells in each group（×200）图1 各组肝星状细胞α-SMA表达量（×200）

2.4 BMSCs促进肝星状细胞的凋亡 流式结果显示，H组、H-H组、M-H-C组HSCs凋亡率较低，且3组差异无统计学意义，M-H组HSCs凋亡率明显高于H组、H-H组、M-H-C组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图2、表1。

2.5 共培养上清液中HGF的浓度 ELISA结果显示，绘制的标准曲线与标准相符（R2=0.99），共培养48 h后，M-H组上清液HGF浓度明显高于H组、HH组、M-H-C组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

Fig.2 The image of apoptosis in hepatic stellate cells图2 肝星状细胞凋亡图

3 讨论

目前肝硬化患者尚缺乏有效的治疗方法，干细胞因具有免疫原性低、易体外扩增、多向分化潜能，给肝硬化患者带来了新的希望。越来越多的研究表明干细胞移植治疗可以逆转肝纤维化和肝硬化，但具体机制尚不明确［4-5］。体内实验发现，BMSCs经尾静脉注射入四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化大鼠体内，肝纤维化程度降低，HSCs的数量较对照组明显减少，凋亡率明显增高，这为BMSCs治疗肝纤维化的机制提供了新的思路［6］。HSCs经体外传代可被激活，活化HSCs细胞外基质的合成和降解失衡，导致细胞外基质增多，从而形成纤维化。

以往研究发现，间充质干细胞（MSCs）通过定向迁移到肝纤维化组织［7］，分化为肝样细胞［8］，并通过抗肝细胞凋亡改善肝功能［9-10］，α-SMA是HSCs活化的标志，MSCs可以抑制成纤维细胞的增殖和α-SMA的表达，并促进基质金属蛋白酶的分泌［11］。Parekkadan等［12］在 BMSCs与HSCs共培养中发现，BMSCs来源的白细胞介素（IL）-10和肿瘤坏死因子（TNF）-α可抑制HSCs的增殖和胶原合成。本研究发现BMSCs与HSCs共培养48 h，BMSCs会明显抑制活化态HSCs的增殖并促进其凋亡，且作用和上清液中HGF的浓度有关，在HGF浓度最高的M-H组中，HSCs的增殖率最低，而凋亡率最高；当封闭HGF受体（c-met）后，增殖率升高同时凋亡率下降，说明BMSCs可能通过分泌的HGF抑制HSCs的增殖并促进其凋亡。韦柳萍等［13］检测了BMSCs与HSCs共培养24、48、72 h后HSCs的凋亡率，发现随着培养时间的延长，HSCs的凋亡率逐渐增加，且在72 h时达到最高。然而，本研究在前期预实验过程中发现，H组在培养72 h后，HSCs的凋亡率也明显增高，说明此时HSCs的高凋亡率并不是由BMSCs引起的，可能是培养体系中未更换新的培养基而无法满足HSCs的生长要求，亦或是HSCs分泌的因子引起的。Wang等［14］将BMSCs与LX2在transwell小室共培养后发现，LX2中α-SMA的表达量明显降低，当敲低c-met后，BMSCs不能改变活化LX2中α-SMA的表达量。本研究结果同样也显示，在BMSCs与HSCs共培养48 h后，BMSCs使活化态的HSCs活性降低，当封闭HGF/c-met信号通路后，效应消失，说明BMSCs可通过分泌的HGF抑制HSCs的活化。

MSCs可以旁分泌多种细胞因子，如HGF、IL-10、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子等。HGF是一种多效生长因子，在细胞的分裂、存活、迁移、形态发生等方面发挥着重要的作用。本研究在M-H组上清液中检测到高浓度的HGF，说明BMSCs可分泌HGF。而HSCs活化后可表达 HGF 受体 c-met［15］，c-met受体属于酪氨酸激酶家族，HSCs通过分泌TNF-α、IL-6等因子刺激MSCs分泌HGF、IL-10等，HGF与HSCs表面的c-met受体结合后激活c-met位点，通过HGF/c-met信号通路对HSCs产生影响。本实验发现，在HGF浓度最高的M-H组中，HSCs的凋亡率最高，HSCs的增殖和活化最低，当封闭HGF/c-met信号通路后，效应消失，表明BMSCs对HSCs的影响可能是BMSCs分泌HGF通过HGF/c-met信号通路起作用的。然而，HGF/c-met下游有Akt/PKB、PI3K、JNK、ERK/MAPK、PIP3等通路，具体是哪条通路起主要作用还有待进一步研究。

此外，MSCs还可通过免疫调节和炎症抑制的作用，抑制T、B淋巴细胞的增殖，促进抑制性细胞因子分泌，减少炎症性细胞因子产生，从而减轻肝脏炎症反应和肝细胞的破坏［16-17］。随着外泌体的提出，越来越多的学者认为MSCs改善肝纤维化与外泌体有关［18-19］。Schorey等［20］认为外泌体为 MSCs与 HSCs间传递通讯的载体。Li等［21］认为来源于人脐带MSCs的外泌体通过抑制肝细胞的上皮-间充质转化、显著恢复血清天冬氨酸转氨酶活性，并通过降低Ⅰ/Ⅲ型胶原、转化生长因子-β1（TGF-β1）以及Smad2的磷酸化，使TGF-β1/Smad信号通路失活，从而改善肝纤维化。

综上所述，BMSCs可使HSCs的增殖、活化受到抑制，凋亡增加，其机制可能是BMSCs旁分泌HGF通过HGF/c-met信号通路起作用的，这也可能是BMSCs移植治疗肝纤维化的机制之一。