饲用植酸酶活性测定关键控制点

2019-02-13于洪莲

饲料博览 2019年8期

于洪莲

（广东溢多利生物科技股份有限公司，广东珠海 519060）

随着畜牧业的发展和饲料生产水平的提高，植酸酶作为一种绿色环保型添加剂广泛应用于单胃动物饲料中，其通过催化将饲料原料中丰富的植酸及植酸盐分解为能被动物利用的无机磷和肌醇，可有效提高植物性饲料中磷、矿物质元素和蛋白质的可利用率，提高动物生产性能，因此植酸酶在饲料生产中可定量取代或减少无机磷的添加量，在降低畜禽养殖成本的同时还减少了动物粪便中磷的排放量，减轻磷对环境污染。植酸酶的研究对解决环境污染和满足营养需求方面有着重要意义。

饲用酶制剂活性分析与检测在饲料工业中具有重要的作用，酶制剂生产企业通过检测产品酶活力来监控产品稳定性，保证酶制剂产品品质，饲料生产企业需要通过检测饲料产品中酶制剂的含量来验证其添加效果（即饲料中酶的活力保存率），以保障饲料品质，因此酶活力的测定是控制酶制剂产品质量的关键环节，也是使用效果的基本保障。如何准确检测植酸酶含量是许多饲用酶制剂工作者普遍关心的问题。本文以国标检测方法为依据，综述了植酸酶活力测定方法及检测中关键控制点，以期为植酸酶的检测提供可行性参考。

1 植酸酶活性测定的方法及原理

1.1 测定方法

《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》是现行有效的饲用植酸酶活性测定的国标方法，即GB/T 18634-2009。本文以国标检测方法为依据。

1.2 测定原理

依据国标检测方法，其原理为：植酸酶在一定温度和pH条件下，将底物植酸水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能与钒钼酸铵生成黄色的复合物，可于波长415 nm下进行比色测定[1]。

1.3 植酸酶活性单位

酶活性单位定义为：样品在37 ℃、pH 5.5 的条件下，每分钟从浓度为5.0 mmol·L-1植酸钠溶液中释放出1 μmol 无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示[1]。

2 植酸酶活性测定的关键控制点

影响植酸酶活性测定的因素很多，如标准曲线的绘制、试样溶液的制备、乙酸缓冲溶液及底物植酸钠溶液的配制、温度、pH、反应时间、离心速度和时间的控制等，这些在酶促反应过程中直接影响反应速率。下面具体介绍饲用植酸酶活性测定的关键控制点。

2.1 标准曲线的绘制

严格按照实国标方法中规定绘制标准曲线，基准物磷酸二氢钾需预先在（105±2）℃电热干燥箱中干燥至恒重，标准品的称量要使用感量为0.000 1 g的分析天平。标准曲线相关系数R2＞0.999，否则需重新绘制标准曲线。新配试剂或更换化验员都需重新绘制标准曲线。

2.2 试样溶液的制备

试样溶液浓度对酶反应的影响：如果其他条件都是适宜的话，在一定范围内随着试样溶液的浓度的增加，酶促反应速率随试样溶液浓度增加而加快，当试样溶液达到一定浓度时，受底物数量限制，酶促反应速率将不再增加，酶活性的测定结果就不准确，因此要从以下几方面控制试样溶液浓度。

2.2.1 酶的提取

按国标的建议称样量称取植酸酶试样（包被植酸酶样品需要研磨处理）两份，精确至0.000 1 g，置于100 mL 容量瓶中，加入乙酸缓冲溶液摇匀并定容至刻度，放入一个磁力搅拌子，在磁力搅拌器上高速搅拌30 min。液体样品无需提取直接稀释备用。搅拌时间不够或搅拌速度过低都会使得酶未完全提取引起检测结果偏差，而提取过程搅拌速度过快会导致液体飞溅使得酶活检测不准确，因此需要保证提取时间及适宜的搅拌速度。注意乙酸缓冲液含有曲拉通和牛血清白蛋白（BSA）成分，在转移或振荡过程中会产生较多的泡沫，所以在稀释过程中应尽量避免因泡沫的体积误差造成稀释倍数低，导致检测结果偏差。

2.2.2 试样溶液稀释

稀释倍数的确定主要依据主要产品推荐酶活性或标示量、称样量和国标方法中要求的试样溶液浓度确定的。国标方法中规定最终试样溶液浓度应保持在约0.4 U·mL-1，试样溶液稀释倍数计算公式为：试样溶液稀释倍数=估计酶活力×称样量/0.4。如：植酸酶估计酶活力为5 000 U·g-1，称样量为1.0 g，其稀释倍数=5 000×1.0/0.4=12 500。试样酶在提取时已稀释100倍，提取后的试样在离心机上以4 000 r·min-1离心10 min，分取不同体积的上清液用缓冲溶液进行逐步进行稀释至12 500倍，移液过程要求准确无误，涡旋混合均匀。

2.3 乙酸缓冲溶液配制

乙酸缓冲溶液是确保整个酶促反应体系pH 的关键因素，需要准确配制后调节pH 为5.50。调节配制溶液pH 使用的酸度计必须校准，所用复合电极必须在使用寿命内。尽管乙酸缓冲溶液在密闭的容器内室温下可存放2个月有效，但存放期＞1个月，建议重新确认pH，如果有变化，需要重新调节pH。

2.4 底物植酸钠溶液的配制

2.4.1 底物植酸钠的型号选择

植酸钠是影响植酸酶活性测定结果的重要因素，李富伟等研究显示，不同型号的植酸钠对测定结果的影响是显著的[2]。因此在酶活性测定中需遵照《饲用植酸酶活性测定分光光度法》（GB/T18634-2009）中规定植酸钠（相对分子质量为923.8、纯度为95%）来选择底物。在测定过程中，如果更换底物的生产厂家、型号及批次，必须对新的植酸钠底物进行反复实验校正，选择适宜的植酸钠底物以便得到正确和统一的酶活性测定结果，这样才有利于确定植酸酶作为饲料添加剂时的准确添加量。

2.4.2 底物溶液浓度

底物浓度是植酸酶活性测定的关键要素。闵兆升等研究表明，底物浓度较低时不能使植酸酶完全催化，但高底物浓度对植酸酶的催化活性也有抑制作用[3]。在底物浓度为0～4.8 mmol·L-1时，酶促反应速率随着底物浓度的增加而加快，反应速度与底物浓度近乎成正比；底物浓度为4.8～6.6 mmol·L-1时，反应速率变化不显著，维持一个较平稳的状态；当底物浓度＞6.6 mmol·L-1时，酶促反应速率随底物浓度的增大而急剧减缓，说明高浓度底物对酶促反应存在抑制作用，因此需要依据国标要求控制底物植酸钠溶液浓度，植酸钠底物配制浓度为7.5 mmol·L-1，实际最终反应浓度为5 mmol·L-1，保证底物浓度是过量的，使得酶促反应充分，得到准确的植酸酶活性测定结果。

2.4.3 底物pH

植酸钠是一种强碱性弱酸盐，溶解于水后显碱性。按国标要求使用乙酸缓冲液（1）配制的，但用已校准过的酸度计检测配制后溶液的pH 已偏离5.50，实验室配制完的底物溶液的pH 约为7.50，需用18%的冰乙酸溶液（避免使用低浓度乙酸调节pH）单向调节pH 至5.50。植酸钠溶液需要现配现用。另注意酸度计的日常维护，电极需浸泡在电极保护液中，测定过酶液、pH过高、pH过低或者黏度很大的样品后，电极反应会变得迟钝，所以一定要仔细冲洗电极，必要时电极需要用强酸浸泡清洗，还要用标准缓冲液校准，才能保证用配制的溶液符合植酸酶活性测定的要求。

2.5 温度控制

在一定温度范围内酶促反应速度随温度的升高而加快，但当温度升高到一定值时，酶促反应速度不再加快反而随着温度的升高而下降。植酸酶活性测定过程中温度是非常关键因素，温度过低或过高都会影响酶促反应速率，因此在检测过程中温度应控制在37 ℃。水浴锅的温度要用标准温度计进行测量校准。保证试样溶液及底物溶液按标准要求预热。恒温水浴锅内水的液面要高于试管内反应液的液面。为了维持水浴的均衡，有条件的实验室最好采用循环水流或振荡水浴。

2.6 反应时间控制

酶活性测定过程中反应时间是一个非常重要的因素，要求各反应管反应时间一致均严格控制在30 min。为了确保获得精确的测定结果，在反应过程中，从反应物混合开始准确计时，向每支试管中加入试剂的时间间隔要一致，且时间间隔要充足，预留出完成下步所需要的时间。

2.7 酶解反应终止及显色液的配制

终止显色液混合顺序，1份钼酸铵溶液+1份偏钒酸铵溶液，最后加入2份硝酸溶液混合均匀后使用，现配现用。使用温水（50～60 ℃）配制偏钒酸铵溶液，易溶解且稳定，配制好的溶液棕色试剂瓶避光保存。

2.8 离心速度和时间的控制

国标方法中规定酶促反应中之后，反应后的试液需在室温下静置10 min，如出现浑浊需在离心机上以4 000 r·min-1离心10 min。在日常实验中发现室温静置或以3 000 r·min-1离心10 min，会导致检测结果偏差，且标准曲线的吸光度不呈梯度。若以5 000 r·min-1离心10 min时，发现标准曲线各梯度的吸光度要低于以4 000 r·min-1离心10 min，因此在实验中应严格控制空白管和样品管离心速度和时间为4 000 r·min-1离心10 min。

2.9 紫外分光光度计测定吸光值

酶促反应结束后，应在1 h 内离心测定吸光度，取上清液以标准曲线的空白调零，在紫外分光光度计415 nm 波长测定试样空白和试样溶液的吸光值。注意试样溶液与式样空白必须澄清，不得有浑浊，测定前用待测溶液润洗比色皿1次，减少误差。吸光度应控制在0.2～0.4，此区间计算的结果误差较小。在检测植酸酶样品时，酶活性的标示量与实际含量可能会差异很大，会导致吸光值或高或低，吸光值未在范围内，需要重新调整试样溶液的稀释倍数再进行检测。