黄睿，张宁

（中国医科大学附属盛京医院第二风湿免疫科，沈阳 110004）

类风湿关节炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是一种比较常见的自身免疫性疾病，它是一种以持续的对称性关节滑膜炎症及可以出现多种自身抗体为特征的系统性疾病［1］。大部分患者病情呈慢性、隐匿性、渐进性发展，由于其初期症状并不典型且不明显，部分患者就诊时已经出现受累关节的影像学改变，且其发病机制和病因尚未十分明确，因此目前临床上诊断RA主要根据患者的临床表现和典型体征、影像学检查及有限的实验室检查指标。此外，现有的治疗方法花费高且潜在不良反应不可避免，即使开始治疗的患者中也至少有40%未达到预期效果，还有一部分患者即使对治疗有反应，但是疾病活动性仍然保持高水平。因此，自身抗体的研究有助于RA患者的早期诊断，从而对患者进行早期干预，延缓甚至阻止关节的破坏，改善预后。很多研究［2］表明，分子水平上的关节损伤开始更早，RA患者体内自身抗体的产生早于患者出现临床表现的时间，在临床前阶段即可检测，也证实了这一点。目前，抗环瓜氨酸蛋白 （circle citrullinated peptide，CCP） 抗体应用较为广泛，其相对于类风湿因子来说具有较高的特异性［3］，已被列入2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟的RA分类标准中［4］。由于RA本身是一种异质性疾病，因此发现一种相对特异性较强的抗体有着很重要的意义。近年来研究人员发现一种新的自身抗体——抗氨甲酰化蛋白 （carbamylated protein，Carp） 抗体，该抗体在抗CCP抗体阴性的RA患者血清中也可以检测到，并可以分为不同的血清型。本研究通过对RA患者血清中抗CCP抗体和抗CarP抗体的水平进行检测，进一步探究其在RA诊断、判断病情活动和预后中的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院风湿免疫科2014年9月至2015年10月收治的135例RA初诊且病程少于2年的患者为RA组，其中女性106例，男性29例；年龄22～74岁，平均（46.36±16.28） 岁；病程1个月～2年；均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟的RA分类标准［5］，且在入选前均未进行过系统治疗。同时选取健康体检者85例作为对照组，其中女性61例，男性24例；年龄23～71岁，平均 （43.65±14.74） 岁；无自身免疫性疾病、关节痛病史。2组一般资料比较差异无统计学意义 （P＞ 0.05） 。

1.2 观察指标

记录RA组患者的年龄、性别、病程、肿胀关节数、压痛关节数、红细胞沉降率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR） 、 C反应蛋白 （C-reactive protein，CRP） ，计算疾病活动度评分 （DAS28），查阅影像学X线片检查报告。依据双手关节X线片，关节病变由轻到重分为Ⅰ～Ⅳ期。Ⅰ期，关节周围软组织肿胀影、关节端骨质疏松；Ⅱ期，关节间隙变窄；Ⅲ期，关节面出现虫蚀样改变；Ⅳ期，关节半脱位和关节破坏后的纤维性和骨性强直。

1.3 抗CCP抗体和抗CarP抗体检测

抗CCP抗体检测试剂盒由上海蓝基生物科技有限公司提供，实验前采受集试者血清3 mL，室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min取上清，-20 ℃分装保存备用。抗CCP抗体和抗CarP抗体检测均采用ELISA方法，各个步骤严格按照说明书进行操作。最后用酶标仪在450 nm 波长时测量各孔的吸光度值。以标准品相对单位浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，据此求出血清中抗CarP抗体及抗CCP抗体的浓度，抗CarP抗体≥10 μ g/mL、抗CCP抗体≥15 RU/mL为阳性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，多组均数比较采用方差分析，相关性检验采用直线相关分析并计算Pearson相关系数，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA方法检测的抗CCP抗体标准曲线

横坐标为标准品浓度，纵坐标为标准品吸光度值，做出抗CCP抗体标准曲线，见图1。

图1 抗CCP抗体标准曲线Fig.1 Standard curve of anti-CCP antibody levels

2.2 ELISA方法检测的抗CarP抗体标准曲线

横坐标为标准品浓度，纵坐标为标准品吸光度，做出抗CarP抗体标准曲线，见图2。

图2 抗CarP抗体标准曲线Fig.2 Standard curve of anti-CarP antibody levels

2.3 抗CCP抗体和抗CarP 抗体对RA诊断的敏感性及特异性比较

RA组135例患者中抗CCP抗体和抗CarP 抗体阳性分别为106例和67例，对照组85例对照者中抗CCP抗体和抗CarP 抗体阳性分别为3例和5例。血清抗CCP抗体和抗CarP抗体检测敏感性分别为78.52%和49.62%，特异性分别为96.47%和94.11%。可见抗CarP 抗体虽敏感性不高，但特异性较高。

2.4 抗CCP抗体和抗CarP抗体联合检测结果

RA组135例患者中抗CCP抗体和抗CarP 抗体同时阳性56例 （41.2%） ，同时阴性20例 （14.8%） ，对照组85例对照者中2种抗体同时阳性2例 （2.4%） ，同时阴性79例 （92.9%） 。抗CCP抗体和抗CarP抗体联合检测诊断RA的敏感性为41.2%，低于单独检测任意一种抗体；2种抗体联合检测的特异性达97.6%，高于单独检测任意一种抗体。可见联合检测抗CarP抗体和抗CCP抗体虽敏感性降低，但特异性很高。

2.5 抗CCP抗体和抗CarP抗体的相关性

将RA组135例患者抗CCP抗体和抗CarP抗体检测结果应用配对四格表结果，经计算Kappa=0.832＞0.75，P＜ 0.001，可以认为抗CCP 抗体与抗CarP抗体检测结果具有高度相关性。见表1。

2.6 RA患者临床数据、实验室指标与抗CarP抗体相关性

RA组中，抗CarP抗体水平与肿胀关节数、压痛关节数、DAS28评分呈显著正相关 （r= 0.61，P=0.001；r= 0.67，P= 0.001；r= 0.62，P= 0.001） ，而与CRP、ESR呈弱正相关 （r= 0.28，P= 0.015；r= 0.35，P=0.018） ，与患者病程 （r= 0.09，P= 0.43） 无相关性。

表1 RA组中抗CCP抗体、抗Carp抗体的相关性Tab.1 Correlation between anti-CCP and anti-Carp antibodies in the RA group

2.7 RA患者抗CCP抗体和抗CarP抗体血清水平与放射学改变的相关性

因本研究入选标准为RA初诊患者，且病程较短（≤2年） ，135例患者中98例 （72.6%） 出现影像学改变，但未发现X线片为Ⅳ期的患者。不同X线分期患者抗CCP抗体和抗CarP抗体血清水平的差异均有统计学意义 （P＜ 0.05） ，即2种抗体血清水平均为Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期，见表2。

表2 RA组中不同X线分期的抗CCP抗体和抗Carp抗体水平比较Tab.2 Comparison of anti-CCP and anti-Carp antibody levels in different X-ray stages in RA group

3 讨论

RA是一种慢性起病、主要累及周身多关节的进行性发展的自身免疫性疾病。多数患者早期关节疼痛并不严重，临床表现不典型，故就诊时已有相当一部分患者受损关节出现影像学的改变。若未及时发现，及早进行药物干预等有效治疗措施，病情逐渐进展，可由最初的滑膜炎发展至滑膜周围组织，关节损伤不可逆转，最终导致患者关节畸形、功能丧失，生活质量下降甚至终身致残［6］。还有一部分患者发生如肺间质纤维化等其他多系统损害［7］。有研究［8］表明，RA患者关节损伤的开始时间甚至早于临床症状出现的时间。因此，早期识别哪些患者更容易出现关节不可逆损伤显得尤为重要。如果可以对这些患者进行早期诊断及治疗，就可以有效降低关节畸形和致残率。由此可见，发现能够提高RA患者早期诊断、预测关节损伤的自身抗体十分有价值。

在抗CCP抗体家族被发现之前，1940年被发现的第一个与RA相关的自身抗体即类风湿因子，其应用广泛，但特异性不强，甚至少部分正常人体内也会出现类风湿因子阳性，而且有研究认为类风湿因子只在疾病的初始阶段价值较大，其预测骨侵蚀的能力随疾病发展降低。之后研究人员通过对自身抗体的进一步探索，发现了一组对RA 特异性很高的自身抗体——抗CCP抗体，这组抗体是针对含瓜氨酸表位蛋白而产生的抗CCP抗体，由于对RA的诊断具有较高的特异性和敏感性而应用广泛［9］。此前很多研究［10］表明，抗CCP抗体阳性的患者发生骨质破坏的风险高于抗CCP抗体阴性的患者，但是在抗CCP抗体阴性的患者中，也有相当一部分患者出现了不同程度的关节损伤和关节畸形。因此，虽然抗CCP抗体对RA患者的诊断、发生、发展有非常重要的价值，但对于那些抗CCP抗体阴性的患者来说，早期诊断也同样重要。近年来，研究［11］发现了一种不同于抗CCP抗体的新的自身抗体——抗CarP抗体。

瓜氨酸是一种由精氨酸脱亚胺酶催化的在翻译后修饰时产生的一种非编码氨基酸［12］。转录后修饰是指在mRNA转录翻译成蛋白质后，有时会对一些特定氨基酸进行共价修饰，常见有氨基酸残基的磷酸化、甲基化、羟基化、糖基化等［13］，其中瓜氨酸化也是其中一种。由于翻译后修饰常使相应蛋白质具有生物活性，故也会导致一些自身免疫性疾病的发生。瓜氨酸化是一种酶促反应［14］，这种反应存在于许多生理过程之中，包括炎症反应在内。在酶的作用下，精氨酸残基转变为瓜氨酸残基。除了瓜氨酸化外，氨基甲酰化也是翻译后修饰的一种，且两者产物极为相似，分别为瓜氨酸和高瓜氨酸，高瓜氨酸比前者多了1个甲基［15］。不同的是氨基甲酰化是一种化学反应，由氰酸盐作用下使赖氨酸转变为高瓜氨酸。即使两者的结构相似，但是抗CCP阴性患者的血清中能检测到抗CarP抗体，提示2种抗体并不一定存在交叉反应，并且后来的抑制试验和免疫印迹试验也证实了这一点［16］。

目前对抗CarP抗体的研究还不够深入，对抗CarP阳性的患者更容易发生骨质破坏的机制尚未完全明了。与含瓜氨酸的表位类似，高瓜氨酸可能提供了与抗体结合的主要位点，RA患者对不同的蛋白进行的氨甲酰化修饰血清反应活性不同，高瓜氨酸周围的氨基酸乃至整个分子可能增强了其免疫原性或使其获得生物学活性；同时，氨基甲酰化后的分子结构改变，导致蛋白活性和功能降低或丧失，与RA相关的酶 （如基质金属蛋白酶2组织抑制因子）活性受抑制。抗CarP抗体阳性的患者在致病因素和发病机制上具有一定的独特性，但他们是否是RA患者中的一类特殊群体还未明了。

本研究的135例患者中，抗CCP抗体和抗CarP抗体阳性率分别为78.5%和49.6%，在抗CCP抗体阴性的29例患者中，11例患者抗CarP抗体为阳性，约占抗CCP抗体阴性患者数的37.9%。SHI等［17］的研究利用氨基甲酰化的胎牛血清作为抗原，检测了557例RA患者和305例健康者，结果表明45%的RA患者中检出IgG型抗CarP抗体，16%的ACPA阴性患者中检测到IgG型抗CarP抗体；43%的RA患者中检出IgA型抗CarP抗体；30%的ACPA阴性患者中检测到IgA型抗CarP抗体。可能由于本研究使用的试剂盒未分型检测抗CarP抗体。

此外，SHI等［8］的另外一项队列研究还认为，抗CarP阳性关节痛患者发展为典型RA的危险性更大，并且更易出现骨质破坏。联合检测2种抗体时诊断RA的敏感性提高至85.2%，特异性达97.6%。SHI等［18］还对2 086名血清中抗CarP抗体阳性的早期关节炎患者进行队列研究，结果表明，抗CarP抗体的敏感性和特异性分别为44%和89%，未发展为RA的关节炎患者主要诊断包括未分类关节炎、反应性关节炎及银屑病关节炎。本研究的结果比SHI等［8］的结果偏高，分析其原因可能因为SHI等的研究是队列研究，选取的是关节痛患者，而本研究选取的是已经符合RA诊断标准的患者，且样本例数较少，造成结果偏高。

本研究还比较了RA患者血清中抗CarP抗体与疾病活动度相关的常用临床指标的相关性，提示抗CarP抗体的存在可能与疾病的活动度相关。但因为样本数量较少，且纳入的患者均为早期RA的患者且未经系统治疗，因此本结论是否适用于所有RA患者还有待进一步研究和探索。有研究［19］表明，至少一半以上的患者在发病的2年内出现关节间隙狭窄和（或） 骨侵蚀，提示关节的破坏在早期就已经发生。本研究中135例类风湿初诊患者有98例 （72.5%） 出现了影像学的改变，可能由于就诊患者没有自觉症状而未就诊的患者表现明显和严重，在这些患者中骨质破坏发生率较高。进一步研究发现，血清抗CCP抗体和抗CarP抗体水平均与骨质破坏程度相关，不同分期的影像学改变患者的抗体水平有显著差异。这提示不仅抗CCP抗体的滴度与RA患者的关节损伤有关，抗CarP抗体水平也与其有关，这对抗CCP抗体阴性的患者来说更具有价值，可能会成为较好的预测指标。同时，一般认为RA患者X线分期与病程呈正相关关系，而本研究结果表明，这组早期的RA组患者抗CarP抗体水平虽与X线分期相关，而与病程无关，考虑到RA隐匿起病，患者症状轻重不一，就诊时间及患者主观因素对病程判断有一定影响，且本研究例数局限，故抗CarP抗体与RA患者病程关系尚需进一步研究证实。

以上研究结果表明，部分RA患者的血清中可以检测到抗CarP抗体，且其与病情活动和骨质破坏相关，提示抗CarP抗体可能参与RA的发生、发展过程，与RA进展有关，有可能成为继抗CCP抗体后的另一个检测RA及判断RA进程的生物标志物。但由于入组患者样本例数不够多，使得本研究具有一定的局限性。抗CarP抗体对RA患者的检测意义和应用价值，有待今后进一步探索。