温行，李章富，王辉，孙绍华，郭星，李福才

（中国医科大学 1. 基础医学院医学遗传学教研室，沈阳 110122； 2. 附属第一医院耳鼻喉科，沈阳 110001）

喉鳞状细胞癌 （简称喉癌） 是人类最常见的头颈部肿瘤之一，伴有高发病率和死亡率，而且预后不良［1-2］。因此，探究喉癌的发生发展机制，寻找其诊断及预后的生物分子标记物至关重要。miR-200c最早发现在多种癌细胞系中表达失调，目前，miR-200c是否参与喉癌的发生和发展尚不明确。肽基脯氨酰顺反异构酶 （peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，NIMA-interacting 1，PIN1） 在中心体复制及分离等过程中发挥着重要作用，在绝大多数人类肿瘤中高表达［3］。前期，本课题组发现过表达PIN1加剧了Hep-2细胞中心体扩增、细胞分裂异常和细胞迁移。本研究将探讨miR-200c对喉癌细胞系Hep-2细胞生物学行为的影响，以及miR-200c是否通过调控PIN1发挥其生物学功能，为喉癌的诊断、治疗和预后分析提供科学依据和线索。

1 材料与方法

1.1 材料

人喉癌细胞系Hep-2；人喉癌组织标本 （取自中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科喉癌患者，全部患者术前未行放化疗，标本保存于-80 ℃冰箱中，所有标本均经病理学检查确诊，并经医学伦理委员会批准及患者知情同意）；RPMI1640培养基 （美国HyClone公司）；qRT-PCR试剂盒 （日本TaKaRa公司）；PIN1和β-actin抗体 （美国Proteintech公司）；BCA测定蛋白浓度试剂盒 （中国碧云天生物技术公司）；苏木素伊红 （HE） 染色试剂盒 （中国碧云天生物技术公司）；Transwell 小室 （美国Corning公司） 。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染：人喉癌细胞系Hep-2细胞培养于RPMI1640培养基 （10%胎牛血清） ，5% CO2，37 ℃孵箱中孵育，24 h更换新鲜培养液。当细胞长满瓶底后，用0.25%的胰酶消化，进行传代。取对数生长期的Hep-2细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到80%时，进行质粒和小RNAs （miR-200c模拟物、模拟物对照、miR-200c抑制物、抑制物对照） 转染。

1.2.2 质粒提取：将含有空载质粒和重组质粒pcDNA3.1-PIN1的菌株按照1∶100的比例接种到200 mL LB培养基 （氨苄青霉素，100 μ g/mL） 中，37 ℃，水平震荡培养箱中过夜培养。第2天，将200 mL菌液加入离心管中，按TIANGEN质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

1.2.3 实时荧光定量PCR：转染48 h后，加入TRIzol试剂提取RNA。使用全式金miRNA反转试剂盒和TaKaRa反转试剂盒合成cDNA。选择U6和GAPDH作为内参对照，反应条件：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。

1.2.4 Western blotting：转染48 h后，裂解细胞提取总蛋白。BCA试剂盒测定各样品蛋白浓度，上样量为20 μ g。电泳，转膜，封闭，孵一抗PIN1 （1∶500） ，β-actin （1∶2 000） ，4 ℃摇床过夜，二抗 （1∶5 000）37 ℃恒温孵育1 h，ECL发光。应用Image J软件进行灰度分析。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验：将野生型wtpGL3-PIN1-3’UTR和 突 变 型mut-pGL3-PIN1-3’UTR质粒分别与miR-200c 模拟物和模拟物对照共同转染至Hep-2细胞，pRL-TK 作为内对照，24 h后收集细胞，应用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.6 CCK8检测：接种细胞于6孔板中并做相应的转染后收集细胞，胰酶消化细胞，调整细胞浓度。96孔板每孔加入100 μ L细胞悬液，间隔24 h，检测前每孔加入100 μ L新鲜培养基 （含10 μ L CCK8试剂） ，培养箱内孵育2 h。测定450 nm处的吸光度 （optical density，OD） 值。

1.2.7 Transwell 实验：接种细胞于6孔板中进行转染，转染后24 h消化细胞，双无培养基吹成细胞悬液，调整细胞浓度。小室上室加入100 μ L细胞悬液，下室加入650 μ L完全培养基，37 ℃培养24 h。取出小室，甲醛溶液固定，苏木素染色。PBS清洗后，用棉签擦干净小室，中性树脂封片。干燥后，显微镜10倍物镜下观察拍照计数。

1.2.8 免疫荧光实验：无菌条件下，将TC处理细胞爬片置于12孔板内，并将细胞接种至孔内，24 h内进行细胞转染。48 h后取出玻片，甲醇溶液固定，丙酮溶液再固定。PBS清洗后，1%BSA封闭液室温封闭2 h。一抗孵育，4 ℃过夜。PBS清洗玻片，孵二抗，避光37 ℃ 50 min。DAPI复染，PBS避光清洗后进行封片，荧光显微镜观察拍照 （400倍） ，统计中心体异常扩增比例。

1.2.9 细胞凋亡实验：接种细胞于6孔板中并进行转染，48 h后胰酶消化细胞。1 000 r/min离心10 min，收集细胞。加入1 mL PBS溶液，轻震悬浮细胞，1 000 r/min离心10 min，弃上清。加入500 μ L 结合缓冲液重悬细胞，加入5 μ L FITC和5 μ L PI，轻轻混匀，室温避光反应20 min，1 h内进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，应用独立样本t检验进行统计学分析，每组实验数据均以表示，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-200c与喉癌发生和发展的关系

以U6为对照，应用实时PCR检测了43例喉癌组织和癌旁正常组织中miR-200c的表达水平。其中，32例 （74%） 癌组织中miR-200c的表达量与癌旁组织相比升高 （图1） 。统计分析结果显示，喉癌组织中miR-200c的平均表达量 （1.86±0.33） 高于相应的癌旁组织 （0.92±0.46） ，差异有统计学意义 （P＜0.05） 。此外，在伴有淋巴结转移的喉癌组织中miR-200c的平均表达量 （0.16±0.06） 显著低于对照组（0.92±0.46） ，差异有统计学意义 （P＜ 0.05） 。

2.2 miR-200c抑制喉癌Hep-2细胞迁移、减弱中心体异常扩增

图1 miR-200c在喉癌组织中的表达水平Fig.1 Expression level of miR-200c in laryngeal carcinoma tissues

在Hep-2细胞中分别转染miR-200c模拟物、模拟物对照、miR-200c抑制物、抑制物对照，并设空白对照组。应用实时PCR检测转染效率，模拟物转染组中miR-200c的表达水平 （0.61±0.02） 与对照组（0.40±0.06） 相比升高，抑制物转染组中miR-200c的表达水平 （0.37±0.02） 与对照组 （0.40±0.01） 相比降低，差异有统计学意义 （P＜ 0.05） ，提示转染成功。CCK8检测结果显示，转染miR-200c相关小RNAs后，Hep-2细胞的生长速率无明显差异 （图2A，P＞ 0.05） 。Transwell小室实验结果显示，miR-200c模拟物转染组穿过小室的Hep-2细胞数 （56.33±16.65） 与对照组（118±19.31）相比显著减少，而miR-200c抑制物转染组（321.67±32.72）与对照组 （109±15.10） 相比增多 （图2B，P＜ 0.05） 。免疫荧光实验结果显示，与对照组 （9.34%±0.72%） 相比，miR-200c模拟物转染组中心体异常扩增的细胞比例 （7.15%±0.35%） 显著降低，而miR-200c抑制物转染组 （11.56%±1.29%）与对照组 （9.02%±0.86%） 相比显著增加 （图2C，P＜0.05） 。细胞凋亡实验结果表明，转染miR-200c相关小RNAs后，Hep-2细胞的早期凋亡率无显著变化 （图2D，P＞ 0.05） 。

2.3 miR-200c靶基因的预测和鉴定

应用TargetScan等软件预测，发现PIN1mRNA 3’非编码区 （3’UTR） 111-117位点为miR-200c的结合部位 （图3A） 。构建野生型和突变型pGL3-PIN1-3’UTR报告基因载体，双荧光素酶报告基因实验结果显示，实验组荧光素酶活性 （0.05±0.02） 与对照组 （0.10±0.01） 相比显著降低，差异有统计学意义 （P＜ 0.05） 。同时，实时PCR和Western blotting结果显示，miR-200c 模拟物组中PIN1蛋白表达水平（0.52±0.16） 与对照组 （0.83±0.06） 相比降低，抑制物转染组中PIN1蛋白表达水平 （1.62±0.16） 与对照组 （1.08±0.24） 相比升高 （图3B，P＜ 0.05） ，而相应的mRNA表达水平无显著差异 （P＞ 0.05） 。

2.4 miR-200c通过调控PIN1抑制喉癌Hep-2细胞的迁移和中心体异常扩增

图2 miR-200c对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响Fig.2 Effect of miR-200c on the biological behavior of Hep-2 cells

图3 miR-200c靶基因的预测和鉴定Fig.3 Prediction and identification of miR-200c target gene

在Hep-2细胞中共转染PIN1和miR-200c模拟物，同时分别转染PIN1、miR-200c模拟物和模拟物对照，并设空白对照组。实时PCR结果显示，与对照组 （0.41±0.04） 相比，模拟物转染组中miR-200c的表达水平 （0.63±0.06） 升高 （P＜ 0.05） ，PIN1转染组中PIN1mRNA表达水平 （0.62±0.08） 与对照组 （0.47±0.03） 相比升高 （P＜ 0.05） ，提示转染成功。Western blotting结果显示，共转染组中PIN1的蛋白表达水平 （1.31±0.24） 与PIN1组 （2.11±0.42）相比降低 （图4A，P＜ 0.05） 。CCK8检测结果显示，Hep-2细胞的生长速率在各组中无明显差异 （图4B，P＞ 0.05） 。Transwell小 室 实 验 结 果 显 示，共 转染组中穿过小室的Hep-2细胞数（399±43.86）与模拟物组（72±19.31）相比显著增多，与PIN1组（523±61.80） 相比显著减少 （图4C，P＜ 0.05） 。免疫荧光实验结果显示，共转染组与模拟物组（7.34%±0.27%） 相比，中心体异常扩增的细胞比例（9.95%±0.74%） 升高，与PIN1组 （12.93%±1.37%）相比显著降低，差异有统计学意义 （图4D，P＜ 0.05） 。细胞凋亡实验结果表明，Hep-2细胞的早期凋亡率在各组中无显著变化 （图4E，P＞ 0.05） 。

3 讨论

miRNAs作为细胞信号通路的一个重要组成部分，越来越多的证据表明，miRNAs是许多生命活动的主要调控因子，如细胞增殖、分化、凋亡、应激反应和血管生成，它们通过结合多个靶基因的3’UTR区发挥作用［4］。研究［5-6］发现，miR-200家族在不同肿瘤中的表达水平不同，例如，miR-200家族在结直肠癌中表达下调，在卵巢癌中高表达。

图4 PIN1对Hep-2细胞增殖、迁移、中心体扩增和凋亡的影响Fig.4 Effect of PIN1 on proliferation，migration，centrosome，and apoptosis in Hep-2 cells

miR-200c最先发现在多种癌细胞系中表达失调［7］。本研究发现miR-200c在喉癌组织中高表达，提示其参与喉癌的发生。有研究［8，10］显示，miR-200c还参与胰腺癌、鼻咽癌和前列腺癌的发生。此外，miR-200c在伴有淋巴结转移患者的喉癌组织中低表达，提示miR-200c在肿瘤转移过程中发挥作用。Transwell小室实验结果表明，miR-200c能够抑制喉癌Hep-2细胞迁移的能力。有研究［11］发现，结肠癌中，miR-200c过表达后能够减弱细胞的侵袭和转移能力。

研究［12-13］表明，miR-200c在肿瘤中是通过其下游靶基因介导发挥作用的，已被证实的miR-200c靶基因有TKS5、JUN等。本研究中，通过TargetScan等生物信息学软件预测发现PIN1mRNA 3’UTR存在miR-200c结合位点，荧光素酶报告基因检测结果证实PIN1是miR-200c的靶基因之一。本研究还发现，Hep-2细胞中miR-200c能够在翻译水平抑制PIN1的表达。

在多数人类癌症中，PIN1呈现出表达上调的现象［14，16］。本课题组前期研究发现PIN1在喉癌中表达上调，下调PIN1的表达抑制了Hep-2细胞的迁移能力，减弱了细胞中心体的异常扩增。有研究［17］发现，乳腺癌中PIN1能够通过Ras信号通路增强c-Jun的转录活性，增强细胞的迁移能力。研究［18］显示，中心体在微管组织、信号传导、极性和细胞分裂中发挥关键作用。目前，中心体失调的时机、机制和影响尚不清楚［19］。有研究［20］报道，PIN1在中心体复制过程中扮演重要角色，PIN1过表达能够诱导中心体扩增、染色体不稳定性和肿瘤发生。

本研究中，发现miR-200c能够通过调控PIN1抑制Hep-2细胞的迁移能力，并降低细胞的中心体异常扩增比例。有研究［21］显示，过表达miR-200c能够通过下调E2F3的表达抑制膀胱癌细胞的增殖能力。miR-200c能够通过下调EDNRA的表达调控胃癌细胞的凋亡过程［22］。本研究结果显示，miR-200c对喉癌Hep-2细胞的增殖和凋亡过程无显著影响，推测此差异可能存在组织特异性。

综上所述，本研究首次发现miR-200c参与喉癌的发生，证实PIN1是miR-200c的靶基因之一，发现miR-200c能够通过调控PIN1抑制喉癌Hep-2细胞的迁移能力并减弱中心体异常扩增。此研究成果为进一步探讨miR-200c作为喉癌诊治的新靶标奠定了重要的科学基础。