于云祥，龚泰芳，刘小涛,柯文,李彬彬

(湖北省十堰市太和医院，湖北十堰442000)

骨关节炎是一种高发于老年人群的退行性病变，以软骨完整性破坏为主要病理特征[1]。骨关节炎主要体现在软骨细胞及细胞外基质减少，其中软骨细胞参与细胞外基质的合成，软骨细胞减少可引起细胞外基质减少。研究[2～4]表明,微小RNA(miRNA)可作为骨关节炎等多种疾病的治疗靶点。因此，探寻miRNA与软骨细胞减少或凋亡的相关性对治疗骨关节炎具有重要意义。研究[5]表明，miR-16-5p对脂多糖(LPS)诱导的肺癌A549细胞损伤具有保护作用，其机制可能与下调CXCR3的表达有关。但关于miR-16-5p对LPS诱导的软骨细胞增殖及凋亡的影响尚未见相关报道。研究[6]表明，miR-497a-5p可通过靶向白细胞介素1受体相关激酶2(IRAK2)减轻LPS诱导的急性肺损伤。IRAK2属于IRAK家族成员，可正向调控细胞内炎症反应[7]。但miR-16-5p是否可通过调控IRAK2基因表达而参与骨关节炎发生过程尚未见报道。2017年12月～2018年12月，本研究采用LPS作为诱导剂构建胎鼠软骨细胞炎症反应模型，观察miR-16-5p、IRAK2基因对关节炎软骨细胞增殖凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 胎鼠软骨细胞获取、质粒及试剂 10只雄性胎鼠(C57BL/6J)购自广东省医学院实验动物中心(动物合格证号：44007200069715)，无菌条件下剪取胎鼠膝关节，0.25%胰蛋白酶消化15 min，无菌PBS洗涤2次，每次3 min，加入0.2%Ⅱ型胶原酶，采用免疫荧光法鉴定软骨细胞。取软骨细胞，放入37 ℃、5%CO2的恒温饱和湿度培养箱内培养4 h，4 ℃下1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基制备单细胞悬液，以3×105/mL的密度接种于25 cm2培养瓶中，放入37 ℃、5%CO2恒温饱和湿度培养箱内进行传代培养。miR-16-5p模拟物(miR-16-5p mimics)及对照模拟物(miR-con)、IRAK2 siRNA(si-IRAK2)及其对照siRNA(si-con)、IRAK2过表达质粒(pcDNA-IRAK2)及其对照质粒(pcDNA-con)购自上海吉玛制药技术有限公司，Lipofectamine 2000及其相关转染试剂均购自美国Invitrogen公司。兔抗鼠细胞周期蛋白1(CyclinD1)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)购自美国CST公司。

1.2 miR-16-5p靶基因预测验证 通过靶基因预测网站starBase预测miR-16-5p靶基因，发现miR-16-5p与IRAK2基因的3′UTR存在结合位点。采用荧光素酶报告基因实验验证miR-16-5p的靶基因：利用基因突变技术将IRAK2基因的3′UTR结合位点进行突变，分别载入荧光素酶报告基因载体，构建野生型报告质粒WT-IRAK2与突变型报告质粒MUT-IRAK2，分别与miR-16-5p mimics、miR-con共转染至胎鼠软骨细胞，双荧光素酶报告基因检测仪测定软骨细胞中荧光素酶活性。

1.3 胎鼠软骨细胞分组 将软骨细胞分成8组。①取对数生长期软骨细胞，分为LPS组、NC组，LPS组细胞加入终浓度为1 μg/mL的LPS 1 mL继续培养24 h[8]，NC组细胞加入1 mL培养基。②取对数生长期软骨细胞，待细胞融合率达到60%时，更换为Opti-MEM减血清培养基，使用Lipofectamine 2000试剂分别转染miR-16-5p mimics、miR-con、si-IRAK2、si-con，转染6 h后更换为含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，继续培养24 h，收集转染成功后的软骨细胞，用1 μg/mL的LPS处理细胞24 h，分别记为LPS+miR-16-5p组、LPS+miR-con组、LPS+si-IRAK2组、LPS+si-con组。③取对数生长期软骨细胞，待细胞融合率达到60%时，更换为Opti-MEM减血清培养基，使用Lipofectamine 2000试剂转染miR-16-5p mimics后分成两组，分别转染pcDNA-IRAK2、pcDNA-con，转染6 h后更换为含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，继续培养24 h，收集转染成功后的软骨细胞，用1 μg/mL的LPS处理细胞24 h，分别记为LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组。

1.4 NC组、LPS组细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA检测 采用qRT-PCR法。根据TRIzol试剂盒说明书逐步提取软骨细胞RNA，待离心管晾干后加入RNase-free水溶解RNA，根据反转录试剂盒说明书配置反转录反应体系，反应条件为37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min，反应结束后得到cDNA。以cDNA为模板，以U6、β-actin为内参，进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循环40次。引物序列如下：miR-16-5p正向引物为5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3′，反向引物为5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；IRAK2 正向引物为5′-AGTACTTCCACATCTGCCCC-3′，反向引物为5′-CACCTCCCTGAGCTTCTTGA-3′；β-actin正向引物为5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，反向引物为5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′。以2-ΔΔCt表示细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA的相对表达量。

1.5 各组细胞增殖能力观察 采用MTT法。取5×104个/mL的各组细胞100 μL，接种于96孔板，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，放入37 ℃恒温培养箱继续培养4 h，弃上清，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀，室温孵育10 min，设置空白孔为空白组，酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度(OD)值，计算各组细胞存活率。细胞存活率=(各组OD值-空白组OD值)/(NC组OD值-空白组OD值)×100%。以细胞存活率表示细胞增殖能力。

1.6 各组细胞凋亡率测算 取5×104个/mL的各组细胞100 μL，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，10 000 r/min离心5 min，收集细胞，PBS洗涤，加入1 mL结合缓冲液重悬，先后加入5 μL Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育20 min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/细胞总数×100%。

1.7 各组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白检测 采用Western Blotting法。取3×105个/mL的各组细胞100 μL，细胞裂解液提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳后，电转至PVDF膜，室温条件下用5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入各蛋白一抗(稀释比为1∶1 000)，再加入相对应二抗(稀释比为1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，滴加ECL显影，应用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值。以目的蛋白灰度值表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 miR-16-5p靶基因验证结果 转染WT-IRAK2、miR-16-5p mimics的软骨细胞荧光素酶活性为0.26±0.05，转染WT-IRAK2、miR-con的软骨细胞荧光素酶活性为1.00±0.10，两者相比，P<0.05；转染MUT-IRAK2、miR-16-5p mimics的软骨细胞的荧光素酶活性为1.02±0.10，转染MUT-IRAK2、miR-con的软骨细胞荧光素酶活性为1.00±0.11，两者相比，P>0.05。上述结果表明miR-16-5p靶向结合IRAK2基因并可负向调控IRAK2的表达活性。

2.2 LPS、NC组细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA相对表达量比较 LPS组细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.10、4.01±0.41，NC组细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA的相对表达量分别为5.33±0.53、0.85±0.09，两组相比，P均<0.05，说明LPS诱导的软骨细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA相对表达量发生变化。

2.3 各组细胞增殖能力比较 LPS组、NC组细胞存活率分别为63.03%±6.31%、100.00%±10.26%，两组相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p组、LPS+miR-con组细胞存活率分别为93.16%±9.32%、65.46%±6.53%，两组相比，P<0.05。LPS+si-IRAK2组、LPS+si-con组细胞存活率分别为91.46%±9.15%、60.45%±6.05%，两组相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组细胞存活率分别为68.08%±6.81%、93.16%±9.31%，两组相比，P<0.05。

2.4 各组细胞凋亡率比较 LPS组、NC组细胞凋亡率分别为28.46%±2.85%、1.59%±0.16%，两组相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p组、LPS+miR-con组细胞凋亡率分别为5.09%±0.51%、30.01%±3.02%，两组相比，P<0.05。LPS+si-IRAK2组、LPS+si-con组细胞凋亡率分别为4.88%±0.50%、29.10%±2.91%，两组相比，P<0.05。LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组细胞凋亡率分别为20.89%±2.10%、6.15%±0.62%，两组相比，P<0.05。

2.5 各组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2、p-NF-κB p65蛋白相对表达量比较 LPS组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为1.20±0.12、0.40±0.04、0.90±0.09、0.25±0.03，NC组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.35±0.05、1.00±0.10、0.10±0.02、0.85±0.09，两组相比，P均<0.05。LPS+miR-16-5p组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.90±0.09、0.28±0.03、0.75±0.08、0.10±0.02，LPS+miR-con组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.42±0.05、0.92±0.09、0.30±0.05、0.88±0.08，两组相比，P均<0.05。LPS+si-IRAK2组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.55±0.06、0.92±0.09、0.30±0.03、0.80±0.08，LPS+si-con组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为1.20±0.12、0.42±0.05、0.90±0.09、0.32±0.05，两组相比，P均<0.05。LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为1.10±0.10、0.55±0.05、0.80±0.08、0.42±0.05，LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.52±0.05、0.92±0.09、0.32±0.05、0.84±0.05，两组相比，P均<0.05。

3 讨论

骨关节炎发病率逐年增加，探究骨关节炎发病机制对研发治疗药物具有重要现实意义。研究[9]表明，骨关节炎发生与miRNA表达异常密切相关，寻找软骨细胞氧化损伤相关新型miRNA分子及其内在作用机制有助于提高骨关节炎防治效果。既往研究[10]采用LPS诱导软骨细胞损伤模型，并用于验证研发药物对骨关节炎的治疗效果。本研究采用LPS诱导软骨细胞制备细胞损伤模型，探讨miRNA在骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡过程中的作用机制。

研究[11]显示，miR-16-5p异常表达与胰岛素抵抗、糖尿病、高血压等疾病密切相关。研究[12]表明，miR-16-5p表达降低可通过上调血管生成因子表达进而参与血管内皮细胞增殖、迁移过程导致微循环功能障碍。本研究结果显示，LPS诱导的软骨细胞中miR-16-5p表达降低、细胞存活率降低、细胞凋亡率增加，与文献[13]报道结果相似，提示LPS可促进软骨细胞凋亡，可能与下调miR-16-5p表达有关。进一步研究显示，上调miR-16-5p表达的软骨细胞存活率升高、细胞凋亡率降低，通过检测细胞增殖及凋亡相关蛋白表达发现，上调miR-16-5p表达后软骨细胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白表达升高，而Bax蛋白表达降低。研究[14]指出，通过提高CyclinD1表达可正向调控软骨细胞周期进程，促进细胞增殖。软骨细胞凋亡在骨关节炎致病机制中扮演重要角色，细胞凋亡与Bcl-2、Bax蛋白表达密切相关，软骨细胞中Bcl-2表达降低可加速细胞凋亡，Bax表达降低可减少软骨细胞凋亡。结合本研究结果，说明上调miR-16-5p表达可促使Bax表达降低，促使CyclinD1、Bcl-2蛋白表达增高，减少软骨细胞凋亡，促进细胞增殖，从而提高骨关节软骨修复功能。

研究[15]发现，IRAK2表达水平升高可促进炎症细胞因子表达，而参与机体内炎症反应发生过程。IRAK2α-螺旋结构域的小分子模拟物可干扰IRAK2和IRAK4之间的相互作用，破坏MyD88与IRAK4、IRAK2形成复合物，从而减轻哮喘等炎症反应。本研究结果显示，LPS诱导的软骨细胞中IRAK2表达升高，抑制IRAK2表达可抑制软骨细胞凋亡、促进细胞存活，与相关文献报道相似，提示IRAK2表达升高可能是促进骨关节炎发生的重要机制。本研究通过双荧光素酶报告实验结果证明，IRAK2是miR-16-5p的靶基因，miR-16-5p可负向调控下游靶基因IRAK2表达。进一步研究显示，上调IRAK2表达联合上调miR-16-5p表达处理后，细胞存活率显著降低、细胞凋亡率显著升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平降低、Bax蛋白表达水平升高，说明IRAK2高表达可逆转miR-16-5p对软骨细胞增殖及凋亡调控的作用。分析其原因，可能是IRAK2通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白表达而发挥作用。

综上所述，LPS诱导的骨关节炎软骨细胞中miR-16-5p低表达、IRAK2高表达，上调miR-16-5p表达、下调IRAK2基因表达均可促进软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡，其作用机制可能与CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白表达有关。