李一，黄婷，杨麟瀚，吴池华

(四川省医学科学院/四川省人民医院，成都 610072)

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一，是所有肿瘤死亡的第五大原因[1]。世界卫生组织的最新统计数据[2]显示，截至2018年全球乳腺癌新发病例约为138万例，占所有新发肿瘤病例的23%，我国每年新发乳腺癌病例和相关死亡人数分别占世界的12.2%和9.6%，并且发病率以每年2%的趋势增长，到2021年中国估计将有250万人患乳腺癌。虽然早期检查和诊断技术的改进以及手术和综合辅助治疗的进步已经显著改善了患者的预后，但乳腺癌患者的总体生存率仍然不理想[3，4]。乳腺癌的发病机制仍未完全明确，但随着对乳腺癌生物学机制的深入理解，其分子靶向治疗逐渐成为可能[5]。Ras相关区域家族1异构体A(RASSF1A)属于RAS效应子家族，其编码一种支架蛋白，通过促进多种效应蛋白复合物的组装来调节多种细胞凋亡和细胞周期检查点通路[6]。研究[7～10]显示，RASSF1A基因在多种肿瘤中被报道为抑癌基因，包括非小细胞肺癌、结直肠癌和胃癌等，在乳腺癌中RASSF1A基因发生高甲基化，可能是乳腺癌的潜在诊断标志物。本研究在细胞水平观察了RASSF1A基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡和体内成瘤能力的影响，探讨RASSF1A基因在乳腺癌发生发展中可能的作用机制，为RASSF1A成为治疗乳腺癌潜在药物靶点提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂、仪器及裸鼠 人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国ATCC细胞库；RASSF1A过表达慢病毒oe-RASSF1A、空白载体慢病毒vector购自上海汉恒生物科技有限公司；RPMI1640培养基和FBS购自美国Gibco公司；培养瓶和培养板等购自美国Coring公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；反转录和qRT-PCR试剂盒等购自日本TaKaRa公司；MTS购自北京百奥莱博生物科技有限公司；细胞周期检测试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；RIPA裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司；磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)抗体(ab32089)、磷酸化PI3K(pPI3K)抗体(ab127617)、蛋白激酶B(AKT)抗体(ab179463)和磷酸化AKT(pAKT)抗体(ab38449)购自英国abcam公司；裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 细胞培养、慢病毒载体感染及分组 取MCF-7细胞培养在含10%FBS的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞融合度为90%左右时，按1∶2的比例进行传代，取生长状态良好的细胞用于实验。取对数生长期的MCF-7细胞以1.5×105个/孔铺至6孔板中，细胞贴壁后将RASSF1A过表达慢病毒oe-RASSF1A和空白载体慢病毒vector与含有5 μg/mL病毒感染增强液的无血清培养基混匀后加入各组细胞中，分别记为oe-RASSF1A组、vector组。

1.3 两组细胞中RASSF1A mRNA的检测 采用qRT-PCR法。两组细胞继续培养72 h后，根据RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板，以β-actin为内参，采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行荧光定量PCR反应。PCR反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40个循环。引物序列如下：RASSF1A正向引物为5′-GTAATGGAAATTTGGGTGTAGGGAT-3′,反向引物为5′-CTAACAACCCAAAATAACAAAACCA-3′；β-actin引正向引物为5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,反向引物为5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。以2-ΔΔCt表示细胞中RASSF1A mRNA的相对表达量。

1.4 两组细胞增殖能力观察 采用MTS法。取两组细胞以每孔3 000个接种于96孔板中，每组设置5个复孔，放置在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。在培养24、48、72、96 h时，更换100 μL新鲜培养基，并加入20 μL MTS检测试剂，37 ℃孵育2 h后，采用酶标仪检测样品在490 nm处的吸光度(OD)值，以OD值表示细胞增殖能力。实验重复3次，取平均值。

1.5 两组细胞周期观察 采用流式细胞实验。两组细胞继续培养72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后计数，取1×106个细胞加入预冷的70%酒精4 ℃固定12 h，重悬于500 μL染色缓冲液中，然后分别加入250 μL PI和10 μL RNase A染液，37 ℃避光孵育30 min，采用流式细胞仪观察细胞周期，计算各细胞周期比例。实验重复3次，取平均值。

1.6 两组细胞凋亡率测算 采用流式细胞实验。两组细胞继续培养72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后计数，取1×106个细胞重悬于500 μL染色缓冲液中，然后分别加入5 μL FITC和5 μL PI染液，37 ℃避光孵育30 min，采用流式细胞仪测算细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.7 两组细胞体内成瘤能力观察 采用皮下移植瘤实验。两组细胞继续培养72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后计数，取1×107个细胞重悬于100 μL PBS中。取4周龄雌性裸鼠10只，分成2组，分别在右侧腋下注射重悬后的两组细胞，常规饲养4周后处死裸鼠，解剖瘤体并称重，以瘤体重表示细胞体内成瘤能力。所有操作均符合动物伦理学。

1.8 两组细胞中RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT和pAKT蛋白检测 采用Western Blotting法。两组细胞继续培养72 h后，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，完全裂解后4 ℃、12 000 r/min离心20 min，BCA试剂盒检测蛋白浓度，煮沸变性后进行SDS电泳，蛋白经湿转移至PVDF膜上，室温经8%牛奶封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，二抗室温孵育2 h，ECL化学发光法曝光条带，采用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞中RASSF1A mRNA相对表达量比较 oe-RASSF1A组细胞中RASSF1A mRNA相对表达量为13.25±3.20，vector组细胞中RASSF1A mRNA相对表达量为1.00±0.03，两组相比，P<0.05。

2.2 两组细胞增殖能力比较 oe-RASSF1A组细胞在培养24、48、72、96 h时的OD值分别为0.36±0.02、0.53±0.06、0.74±0.13、0.91±0.07，vector组细胞在培养24、48、72、96 h时的OD值分别为0.35±0.03、0.62±0.14、0.95±0.08、1.34±0.21，其中，在培养72、96 h时两组的OD值相比，P均<0.05。

2.3 两组细胞周期比较 oe-RASSF1A组细胞处于G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为60.02%±3.21%、18.30%±2.31%、22.11%±1.03%，vector组细胞处于G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为63.67%±4.16%、21.04%±2.65%、15.32%±2.52%，其中oe-RASSF1A组细胞处于G2/M期的比例与vector组相比，P<0.05。

2.4 两组细胞凋亡率比较 oe-RASSF1A组细胞凋亡率为24.38%±5.80%，vector组细胞凋亡率为4.25%±0.92%，两组相比，P<0.05。

2.5 两组细胞体内成瘤能力比较 注射oe-RASSF1A组细胞的裸鼠成瘤的瘤体重为63.29±14.03 mg，注射vector组细胞的裸鼠成瘤的瘤体重为104.58±17.52 mg，两组相比，P<0.05。

2.6 两组细胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT和pAKT蛋白相对表达量比较 oe-RASSF1A组细胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白相对表达量分别为8.67±1.32、0.86±0.21、0.26±0.15、0.91±0.11、0.30±0.07，vector组细胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白相对表达量分别为1.05±0.04、1.00±0.00、1.01±0.01、1.04±0.04、1.00±0.00，其中，两组细胞RASSF1A、pPI3K、pAKT蛋白相对表达量相比，P均<0.05。

3 讨论

乳腺癌是一种起源于乳腺导管上皮或乳腺小叶的恶性肿瘤，其发病率占女性所有肿瘤的30%，常见发病年龄为20～59岁之间，其死亡率占女性肿瘤相关死亡原因的第一位，已经成为全球范围内的公共卫生问题[11]。乳腺癌是一组具有不同临床和组织学形式的异质性疾病，虽然对其发病机理在不断的研究，但是其致病机制尚未完全阐明，进一步在分子水平了解其发生发展机制，寻找有效的药物作用靶点，对更好的治疗乳腺癌具有重要的意义。目前最常用于对抗乳腺癌的策略包括手术切除病灶、放射治疗、辅助化疗、激素治疗和靶向治疗。近年来，乳腺癌的诊断和治疗取得了很大进展，尤其是乳腺癌的外科治疗，但是乳腺癌的复发和转移率很高，手术对于晚期患者治疗效果有限[3,12]。紫杉醇、雌激素受体的部分激动剂他莫昔芬和多柔比星等化疗药物均是治疗乳腺癌的有效药物，但在对抗乳腺癌时最大的挑战是肿瘤细胞的化学抗性，化疗药物对乳腺癌晚期患者治疗效果不佳[4,13]。目前乳腺癌治疗的主要研究方向是靶向药物治疗，其毒副作用较低、安全性较高，曲妥珠单抗、拉帕替尼和贝伐单抗等靶向药物均取得了显著的疗效[5]，但是乳腺癌患者的预后并未达到理想的效果，因此开发新的有效分子靶向药物非常关键。

RASSF1A基因位于染色体3p21.3上，广泛表达于各种正常组织，而在肿瘤组织中常表达缺失，是一种抑癌基因。研究[14]显示，RASSF1A基因的耗竭是肿瘤起始和进展的基础。RASSF1A是RASSF(RAS关联结构域)家族成员之一，可与活化的K-RAS形成内源性复合物，但是RASSF1A没有酶活性，充当K-RAS调节的支架，将K-RAS连接到多种信号传导通路进行调节[15]。RASSF1A属于RASSF家族中研究较多的成员，在非小细胞肺癌、结直肠癌等人类肿瘤细胞中观察到RASSF1A基因发生表观遗传沉默[7，8]。已报道的研究[16]中，RASSF1A基因可刺激有丝分裂停滞、DNA修复和细胞凋亡，并控制细胞周期和细胞迁移。研究[17]显示，RASSF1A基因在正常乳腺细胞中表达，在正常乳腺组织中显示8%的启动子高甲基化，而在乳腺癌组织中高达56%的启动子发生高甲基化，RASSF1A发生DNA甲基化而表达降低在乳腺癌中较为常见，越来越多的研究表明RASSF1A和乳腺癌密切相关。本研究采用慢病毒技术增加乳腺癌细胞株MCF-7中RASSF1A的表达，观察RASSF1A对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，结果发现RASSF1A在体外抑制MCF-7细胞的增殖活性，诱导细胞周期阻滞在G2/M期，并促使细胞发生凋亡，在体内抑制MCF-7细胞的成瘤能力，表明RASSF1A通过调控肿瘤细胞的增殖和凋亡参与了乳腺癌的发生发展。

已经观察到RASSF1A对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，其具体的作用机制需进一步研究。研究[18]发现，RASSF1A是RAS效应因子，在K-RAS的影响下，RASSF1A可以结合凋亡调控相关蛋白MOAP-1，MOAP-1通过结合并激活促凋亡执行因子BAX发挥作用。RASSF1A还结合MST(Hippo)激酶以将K-RAS连接到Hippo信号途径[19]。此外RASSF1A可通过引起鸟嘌呤核苷酸交换因子1(GEF-H1)、RhoB失活发挥功能[20]。K-RAS引起Ras癌基因突变的激活，活化的RAS被认为主要通过结合和激活三种主要类型的促有丝分裂效应蛋白：RAF激酶、PI3K和RALGEF家族来发挥作用，以刺激促生长和存活信号途径[21]。其中PI3K的激活导致促有丝分裂脂质的刺激和AKT信号途径的激活。研究[22]显示，PI3K/AKT信号途径是调控肿瘤增殖和凋亡的重要通路之一，在乳腺癌中PI3K/AKT信号途径异常激活，可作为抗肿瘤药物治疗乳腺癌抑制信号通路之一[23]。Li等[24]在有关肝细胞肝癌的研究中报道，RASSF1A通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路增强自噬。我们推测，RASSF1A可能通过调控PI3K/AKT信号通路发挥抑制细胞增殖和促进凋亡的作用。本研究结果显示，过表达RASSF1A后，MCF-7细胞中PI3K和AKT总蛋白无明显变化，发生磷酸化作用的pPI3K和pAKT蛋白表达降低，表明RASSF1A可能通过抑制PI3K/AKT信号通路而在乳腺癌中发挥重要功能。

综上所述，RASSF1A可能通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡。RASSF1A在乳腺癌中为抑癌基因，具有成为乳腺癌治疗药物靶点的潜力。