柳吉芹 王立杉 吴曦 钱云开 高飞 王海洋

摘要 ：小麦线条花叶病毒（WSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。2018年5月秦皇岛海关利用反转录PCR（RT PCR）和双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS ELISA），从加拿大进口的大麦中检出WSMV。同时利用实时荧光定量PCR （Real time RT qPCR）和序列比对分析方法进行了验证。这是我国首次在进境加拿大大麦中截获WSMV。

关键词 ：小麦线条花叶病毒; 大麦; PCR; ELISA; 序列比对分析

中图分类号：

S 435.121

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018409

Identification of Wheat streak mottle virus on imported barley from Canada

LIU Jiqin1， WANG Lishan1，2， WU Xi1， QIAN Yunkai1， GAO Fei1， WANG Haiyang1

（1. Qinhuangdao Custom， Qinhuangdao 066004， China; 2. Hebei Normal University of

Science and Technology， Qinhuangdao 066004， China）

Abstract

Wheat streak mosaic virus （WSMV） was one of the most important quarantine pests in China， which had caused significant economic losses in USA. WSMV was detected in the samples of imported barley from Canada using reverse transcription PCR （RT PCR） and double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay （DAS ELISA） methods by Qinhuangdao custom in May 2018， which was further confirmed by real time RT qPCR and sequence alignment analysis. This was the first report on interception of WSMV on imported barley from Canada.

Key words

Wheat streak mosaic virus; barley; PCR; ELISA; sequence alignment analysis

小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）是马铃薯Y病毒科Potyviridae， 小麦花叶病毒属Tritimovirus成员[1]，是我国进境植物检疫性有害生物。20世纪20年代，该病毒首次发生于美国中部平原地区[2]，后蔓延至澳大利亚、加拿大、乌克兰等国家或地区[3]。小麦线条花叶病毒可侵染小麦、燕麦、大麦及部分玉米品种[4]，引起寄主植物严重花叶和矮化，最高可引起减产100%。该病毒容易通过汁液摩擦方式近距离扩散，并能通过带病种子的调运远距离传播，传毒介体为小麦卷叶螨Aceria tosichella[5]。1982年该病毒曾在我国新疆、甘肃局部地区发生过，之后未见报道[67]。由于该病毒的自然寄主小麦为我国的主要粮食作物，一旦扩散，必将会对我国的农业生产和生态环境安全造成巨大威胁，因此需加强该病毒的检疫。2018年5月，我们通过血清学、分子生物学检测法，从一批加拿大进口的大麦中检出小麦线条花叶病毒。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

小麦线条花叶病毒的阳性标准物质和WSMV的双抗体夹心酶联（DAS ELISA）检测试剂盒购自美国Agdia公司。荧光探针与引物、One Step RT PCR Kit（Perfect Real Time， RR064A）、One Step RT PCR Kit（RR055A）购自TaKaRa公司。实时荧光PCR仪为ABI Steponeplus。普通PCR仪为ABI 9700。PCR产物送至北京擎科新业生物技术公司进行测序。病毒RNA提取试剂盒（RN53）购自艾德莱公司。Model 4001P电泳仪购自Life Technologies公司，Nu Genius凝胶成像系统购自Syngene公司。Multiskan Ascent酶标仪购自Thermo Scientific公司。

1.2 DAS ELISA检测

將大麦种子研磨成粉，取100 mg用于DAS ELISA检测，测试方法参照试剂盒说明书。每个样品设两个平行。在酶标仪上直接读取OD405，当样品OD405≥ 2×阴性OD405时，样品被判定为阳性，即携带有病毒，否则判为阴性。

1.3 病毒RNA提取及RT PCR检测

取100 mg磨碎的大麦粉，按照病毒RNA提取试剂盒操作说明书提取病毒RNA。RT PCR扩增体系参照One Step RT PCR Kit说明书，反应体系为：2×One Step Buffer 25 μL;RNase free ddH2O 20 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL;PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL;最后加入2 μL RNA模板，总体积50 μL。每个样品设3个平行，并设置阴性对照与空白对照。反应程序为：50℃ 30 min;94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，共36个循环;72℃ 5 min;4℃保存。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 实时荧光RT qPCR检测

实时荧光RT qPCR扩增体系参照One Step RT PCR Kit （Perfect Real Time）说明书，反应体系为：2×One Step RT PCR BufferⅢ10 μL;RNase free ddH2O 5 μL;上、下游引物（20 μmol/L）各0.6 μL;荧光MGB探针（20 μmol/L） 0.6 μL;ROX reference dye （50×） 0.4 μL;TaKaRa EX TaqTM HS（5U/μL） 0.4 μL;PrimeScriptTM RT Enzyme MixⅡ0.4 μL;最后加入2 μL RNA模板，总体积20 μL。每个样品设3个平行，并设置阴性对照与空白对照。反应程序为：42℃ 15 min，95℃ 10 s;然后95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45个循环。实时荧光RT qPCR利用荧光定量PCR仪自带的软件进行结果分析，根据阴性对照结果设定阈值线，扩增曲线及样品Ct值由软件自动生成。

1.5 序列分析

利用DNAStar分析软件对测定的PCR序列进行装配;序列同源性比较分析采用BLAST（Basic Local Alignment Search Tools）工具（http： ∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）;序列多重比对采用Cluster X;系统进化树分析采用MEGA 5.0软件，通过邻接法（NJ）构建系统发育树作聚类分析，Boot strap自展检验重复1 000次。

1.6 引物与探针序列

引物与探针序列见表1。

2 结果与分析

2.1 DAS ELISA检测结果

经DAS ELISA分析发现，大麦两个平行样品OD405均值为0.393，阳性对照OD405为0.663，阴性对照OD405为0.113，空白对照OD405为0.095（表2）。大麦样品OD405> 2×阴性对照OD405，因此大麦样品检测为阳性，即携带小麦线条花叶病毒。

2.2 RT PCR检测结果

大麦3个平行样品的总RNA用WSMV F2/R2引物扩增均得到约190 bp的特异性片段，片段大小与阳性对照一致，而阴性对照和空白对照均未出现特异性条带（图1）。我们将此毒株命名为 WSMV Can01。

2.3 实时荧光RT qPCR检测结果

实时荧光RT qPCR分析发现，大麦3个平行样品均有典型的扩增曲线，Ct均值为32.41，阳性对照Ct值为28.01，阴性对照和空白对照均無扩增（图2），该结果进一步证实该批大麦样品含有小麦线条花叶病毒。

2.4 CP基因克隆

利用特异性引物WSMV CP F571/WSMV CP 1267R对CP基因片段进行PCR扩增，得到约700 bp的特异性条带，而阴性对照和空白对照均无扩增（图3）。

2.5 序列比对与系统进化分析

将上述约700 bp的扩增产物测序并进行NCBI BLAST比对分析，发现WSMV Can01与美国已发生的小麦线条花叶病毒相似度最高。从数据库中下载与其相似度较高的WSMV序列，以燕麦坏死斑驳病毒Oat necrotic mottle virus（ONMV）作为外群，构建系统发育树（图 4）。系统发育图显示：本次从加拿大进口大麦中检出的 WSMV Can01与美国分离株CO87、PV57聚为1支，其相似度达99%;与美国分离株Sindey 81、加拿大分离株IHC聚为第2支，相似度为98%;与美国分离株MON96、WA99、阿根廷分离株Arg2聚为第3支，相似度为97%;与伊朗分离株Iran聚为第4支，相似度为95%;与捷克分离株Czech、德国分离株Hoym、法国分离株Marmagne聚为第5支，相似度为93%～94%;与墨西哥分离株EI Batan 3亲缘关系较远，后者独自聚为一个分支。此外，ONMV（AY377938）作为外群与WSMV Can01的亲缘关系更远。2002年Stenger等基于WSMV CP全长基因（1 267 bp）构建系统进化树，发现WSMV可分为A、B、C、D 4个不同的簇[11]，WSMV Can01属于D簇。

3 讨论

为确保检测结果的准确性，我们采用了RT PCR、实时荧光RT qPCR和DAS ELISA三种方法进行鉴定，并通过对WSMV CP基因片段的测序与比对分析，最终证实加拿大进境的大麦中含有小麦线条花叶病毒。本研究基于CP基因片段构建的系统进化树与Stenger等基于CP全长基因构建的系统树基本一致[11]，表明该片段具有足够的多态性和进化特征。加拿大进境的大麦中检测到的小麦线条花叶病毒与美国分离株相似度最高，而与加拿大分离株相似度略低，这可能与两个国家之间的种子调运密切相关。该批疫麦19 994 t，拟作啤酒原料。目前世界上还没有有效的化学药剂以及种子处理技术来防治小麦线条花叶病毒和小麦卷叶螨。为防止疫情扩散，秦皇岛海关加强监管，对该批大麦储存场所，卸货、运输过程，加工工艺、下脚料处理等环节进行风险评估;制定专项监管方案，防止接卸、储存、加工过程中疫情扩散;监督货物存放，避免交叉污染;及时对下脚料、成品及生产用水实施无害化处理。

参考文献

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（责任编辑：杨明丽）