张文婧，娄晓鸣，朱旭东，金立敏

（苏州农业职业技术学院，江苏苏州215008）

植物组织培养技术自20世纪60年代开始已逐渐走向工厂化和商品化阶段，现在植物组织培养已经变成一种常规试验技术，广泛应用于植物的脱毒、快繁、基因工程、细胞工程、遗传研究、次生代谢物质的生产、工厂化育苗等多个方面，几乎每天都有可能出现利用新的植物种类获得培养成功的报道。贝母属植物在中国主要研究应用集中在药用价值方面，利用组织培养快繁技术可以克服其在种子繁殖和鳞茎繁殖技术上的不足，大大提高观赏贝母繁殖的速度，是实现观赏贝母产业化生产的有效途径。其中药用贝母组织培养快繁技术方面的研究很多，但观赏贝母的组织培养技术相对较少，目前仅有汤甜等[12]在3种贝母的快繁及离体保存技术研究中做了比较具体的探究。该研究以3种观赏贝母的鳞片为外植体，探讨了不同品种的出芽率、增殖率、生根情况及炼苗成活生长情况，为观赏贝母组织培养工厂化生产提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料选择从荷兰C B TC国际园艺有限公司进口，未经栽种过的无病害、无明显外伤的健康种球鳞片作为外植体材料，供试品种为冠花贝母（F.imperialis‘Rubra Maxima’）、紫花贝母（F.uva-vulpis）和弯尖贝母（F.acmopetala）；试验耗材为MS培养基、蔗糖、琼脂粉、75%酒精、10%次氯酸钠、0.1%H g C l2、BA、NAA。

1.2 方法

1.2.1 外植体选择及消毒。冠花贝母‘鲁布拉’剥取鳞茎中内层（2层以内）无病无机械损伤鳞片的中下部，紫花贝母和弯尖贝母由于种球较小，所以选择整个鳞茎作为外植体。外植体用洗涤剂洗净后置于流水下冲洗30 m in，冲洗完成后在无菌操作台用75%酒精浸泡30 s，10%次氯酸钠溶液浸泡25 m in，浸泡完成后用无菌水冲洗3~5次，置于无菌滤纸上吸干多余水分备用。

1.2.2 培养基的选择及处理。查阅文献，制定外植体诱导、继代和生根培养基配方（表1）[12]。诱导分化培养基、增殖培养基均用MS固体培养基，附加不同浓度的6-BA和NAA，加琼脂7 g/L、蔗糖30 g/L，p H 5.8，培养温度25±1℃，光照时间12 h/d，光照强度2 500 lx；生根结球培养基选用1/2固体培养基，为促进鳞茎球的形成，蔗糖浓度提高到60 g/L，先暗培养2周后转为2 500 lx，12 h/d光培养。

表1 观赏贝母组织培养快繁体系培养基

诱导培养，将消毒后的鳞茎切割成0.8 c m左右见方的小块，以背面朝下接入诱导培养基，接种后每5 d观察1次生长情况，20 d后统计3个品种观赏贝母的污染率、死亡率，35 d后统计各品种外植体的分化情况；增殖培养，当诱导芽长至1~2 c m时转接入继代培养基，接种后每5 d观察1次增殖情况，25 d后统计增殖率；继代培养，35~40 d后可继续转接进行下一轮增殖培养或转入生根培养基进行生根结球培养；生根培养，将健壮的增殖苗转接入生根培养基，先暗培养2周后转为2 500 lx，12 h/d光培养，生根结球培养45 d后统计生根、结球情况；炼苗移栽，挑选生长情况良好的生根苗在20~25℃、相对湿度85%的环境中进行炼苗移栽，炼苗基质为草炭∶砻糠灰∶珍珠岩7∶2∶1，炼苗90 d后统计各品种成活率。

2 结果与分析

2.1 外植体的诱导与分化

从表2可以看出，在同一种消毒方法下，3种观赏贝母的污染率、死亡率不同，效果最好的是弯尖贝母，总体成活率可达90%，其次为紫花贝母，这和2个品种本身鳞茎较小、鳞茎包裹紧实、内部比较干净有一定关系。冠花贝母‘鲁布拉’鳞茎较大，内部中空，外界污染物极易侵入，难以消毒彻底，因此初代培养污染率与其他2个品种相比较高。

从表3可以看出，3种观赏贝母在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基中均能较好地进行分化，外植体接入诱导培养基1周后，鳞片逐渐转绿并陆续发生分化，30 d左右可见出芽。试验中发现冠花贝母鳞茎多为不形成愈伤组织直接诱导产生不定芽，在鳞片腹面直接分化出小突起，小突起2周左右可继续分化为叶的不定芽，部分前期形成愈伤组织后期也会玻璃化，无法诱导出不定芽；而弯尖贝母和紫花贝母鳞茎则多在外植体腹面近切口处或于切口处先形成不规则的黄绿色或绿色愈伤组织，再分化出乳白至嫩黄色半透明或不透明的不定芽，分化率和出苗率都比较高，能够产生大量不定芽且出芽整齐。

表2 不同品种污染率比较

表3 不同品种外植体的分化情况

2.2 继代增殖与生根培养

从诱导培养的结果可以看出，冠花贝母多从鳞茎直接诱导产生不定芽，而弯尖贝母和紫花贝母则为先诱导愈伤组织，因此从诱导培养转入继代培养2周后，冠花贝母从苗基部生出新的增殖苗，弯尖贝母和紫花贝母由愈伤组织再分化出不定芽。从表4可以看出，3个品种观赏贝母继代培养40 d时，弯尖贝母增殖情况最好，污染率低，且增殖芽生长健康，叶色浓绿；其次为紫花贝母，生长情况良好；增殖率最低的是冠花贝母，由于多为直接诱导的不定芽，所以增殖系数仅为2.07，试验中还发现冠花贝母部分幼苗出现了不同程度的畸形、玻璃化现象。

组培苗在继代培养过程中，已有个别苗出现生根现象，但是根数很少，生根培养20 d左右可生出白色或淡绿色的根。从图1中可以看出，弯尖贝母、紫花贝母在1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L、蔗糖浓度60 g/L的生根培养基中生根效果良好，根量多，发根整齐，基部小鳞茎膨大明显，苗健壮；冠花贝母在同样培养条件下也能正常生根，生根率高，但小苗抽叶少，几乎无小鳞茎膨大，对后期移栽炼苗带来困难。

表4 不同品种增殖情况

图1 3个品种繁殖率对比

图2 3个品种炼苗成活率

2.3 组培苗的移栽

在上一阶段培养得到的生根苗新根长到1~2 c m时，开瓶在自然环境中适应5~7 d，取出洗净根系上附着的培养基等物质，移入消毒后的草炭∶砻糠灰∶珍珠岩7∶2∶1基质中，保持85%的湿度，50~60%自然光照，每日喷洒2次水，20 d左右喷1次稀释MS营养液，观察其生长情况。从图2可以看出，弯尖贝母、紫花贝母成活率高，生长良好，尤其是弯尖贝母炼苗成活率高达100%，冠花贝母成活率偏低，极易死亡，这与其移栽小苗根部没有新生鳞茎球有关。

3 结论与讨论

试验表明，75%酒精30 s+10%次氯酸钠25 m in对3种观赏贝母的消毒效果较好，冠花贝母由于鳞茎较大，易产生内生菌，污染率较高。在同样的培养环境中，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L为诱导培养基，完成初代诱导后转入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L增殖培养基后，发现弯尖贝母、紫花贝母先形成不规则的黄绿色或绿色愈伤组织，再分化出乳白至嫩黄色半透明或不透明的不定芽，分化率和出苗率高，且出芽整齐，生长良好。

观赏贝母作为球根花卉，其生根过程中是否有小鳞茎产生，是组培产业化生产的重要部分，具有小鳞茎的组培苗移栽成活率高。在生根培养中发现增加蔗糖浓度可以提高结球率，但浓度过高会抑制新叶的生长，因此该试验中蔗糖浓度设定为60 g/L，同时结合2周的暗培养来促进观赏贝母鳞茎球的产生。从试验结果可知，弯尖贝母、紫花贝母在此培养基中生根率高，能很好地形成小鳞茎且植株生长健壮，后期移栽炼苗成活率高；冠花贝母虽然生根率高，但很难直接诱导出小鳞茎，在培养过程中易产生内生菌和玻璃化现象，因此后期移栽炼苗成活率也很低，生长情况不佳。

通过试验可得出，紫花贝母、弯尖贝母这2个品种可运用组织培养快繁技术扩大数量进行推广，并进一步研究冠花贝母小鳞茎形成技术，以提高冠花贝母的繁殖速度。利用组织培养快繁技术可在短时间内获得大量种苗，对于帮助解决观赏贝母市场种球价格昂贵、常规繁殖率低等问题具有一定的意义。