曹继芬 霍超 户艳霞 王新中 徐发华 赵志坚

摘  要：為明确大理州烟草疫霉的群体结构和抗药性水平，采用对峙培养法和含药平板法研究了2013—2014年大理州烟区烟草疫霉的交配型和对甲霜灵敏感性。结果表明，测定的大理州烟区的150个烟草疫霉菌株全部为A2交配型，未发现A1或A0交配型;263个烟草疫霉菌株对甲霜灵的EC₅₀值分布于1.0829～33.6227 mg/L，平均EC₅₀为8.7599±0.0358 mg/L。大理州烟草疫霉菌株对甲霜灵的敏感性差异显著，敏感、中抗和抗性菌株在群体中的比例分别为14.83%、52.85%和32.32%。大理州烟草疫霉在其侵染循环中主要进行无性繁殖，病原菌对甲霜灵的抗药性水平较高，中抗和抗性菌株分布广泛，亟需加快其他新型高效安全替代制剂的筛选和应用。

关键词：烟草黑胫病;烟草疫霉;交配型;甲霜灵敏感性

中图分类号：S435.72          文章编号：1007-5119（2019）06-0049-06      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.06.007

Mating Type and Metalaxyl Sensitivity ofPhytophthora nicotianae on Tobacco Black Shank Disease in Dali， Yunnan

CAO Jifen¹， HUO Chao¹， HU Yanxia²， WANG Xinzhong²， XU Fahua²， ZHAO Zhijian^1*

（1. Industrial Crops Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205， China; 2. Dali Branch of Yunnan Tobacco Company， Dali， Yunnan 671000， China）

Abstract：In order to investigate population structure and metalaxyl resistance level ofPhytophthora nicotianaeon tobacco black shank disease， the methods of confrontation culture and fungicide-amended plate were used to determine mating type and sensitivity to metalaxyl ofP. nicotianaeisolates collected from 2013 to 2014 in Dali， Yunnan Province. The results showed that all 150 isolates ofP. nicotianaefrom 12 counties were A2 mating type and A1 or A0 mating type was not identified. The EC₅₀values of a total of 263 isolates to metalaxyl distributed between 1.0829 and 33.6227 mg/L， with an average EC₅₀value of 8.7599±0.0358 mg/L. The ratio of sensitive， moderate resistant and resistant population was 14.83%， 52.85% and 32.32%， respectively， which means that sensitivity to metalaxyl ofP. nicotianaeisolates collected from Dali had significant differences. Our results suggest that the population structure of P. nicotianaewas mainly maintained through asexual propagation in its life cycle in Dali. The pathogen had a high resistance level to metalaxyl and both moderate and resistant isolates were widely distributed. It is urgent to screen and make use of new high-efficiency and safe alternatives for black shank disease management.

Keywords：tobacco black shank disease;Phytophthora nicotianae; mating type; metalaxyl sensitivity

烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）被认为是最具破坏性的土传植物病原卵菌之一，目前已报道超过90科255属的植物是其寄主。由于寄主和生态位的多样性，烟草疫霉在全球引起的经济损失通常难以估计^[1]。由烟草疫霉引发的黑胫病（Black shank disease）是烟草生产中最主要的病害，在我国各烟区不仅分布广泛，而且普遍发病率高^[2]。系统了解烟草疫霉的群体特征及其动态规律，可以有效地服务于各烟区黑胫病的科学防控。云南省大理州是我国规模最大的特色优质烤烟品种红花大金元种植基地。由于红花大金元是感病品种，且烟苗移栽后当地烟农常采用漫灌的方式进行灌溉，高温高湿条件下非常适宜于烟草黑胫病的传播和流行。大理州烟苗移栽后5～7 d即有黑胫病发生，田间调查发病率为8.0%～21.5%，严重烟田病株率在30.2%～80.0%，甚至绝产，经济损失十分严重^[3-4]。因此，监测病原菌特征，科学地开展黑胫病防控对烟叶绿色生产、提质增效有重要意义。

有性生殖过程被认为是增强病原菌遗传多样性和致病性的主要原因。烟草疫霉是异宗配合的卵菌，需要A1和A2两种相反交配型共存才能进行有性生殖产生卵孢子。A1和A2交配型的相对比例可以揭示烟草疫霉在自然田间条件下发生的有性重组水平以及卵孢子产生的潜力。已报道的烟草疫霉存在A1、A2和A0三种交配型，不同交配型在自然界中的相对频率通常具有偏向性^[5]。尽管种植抗病品种是防控黑胫病最经济有效的措施^[6]，但由于产业需求和高品质抗病品种匮乏等原因，目前生产上对烟草黑胫病的防控仍然以化学防治为主。甲霜灵是苯酰胺类杀菌剂，特异性地抑制病原菌mRNA合成，广泛地应用于霜霉病、疫霉病等各种卵菌病害的防治。由于其作用位点单一，病原菌易产生抗药性，从而导致防治效果明显下降^[7]。近年来对我国一些烟区的监测结果显示，烟草疫霉在山东、贵州、四川、河南和重庆等省市对甲霜灵等杀菌剂已经存在不同程度的抗药性^[8-9]。

大理州烟区从上世纪90年代初开始使用甲霜灵进行烟草黑胫病防治，但目前对当地烟草疫霉的甲霜灵抗药性风险以及有性生殖在烟草疫霉群体遗传结构中的作用尚不清楚。本研究监测了大理州烟草疫霉的交配型组成以及甲霜灵抗药性水平，研究结果有助于正确地了解当地烟草疫霉有性生殖在病原菌遗传多样性和致病性分化中的作用以及抗药性程度和分布，可为大理州烟草黑胫病防治化学杀菌剂的选择和绿色防控提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  供试菌株  2013—2014年从云南省大理州12个县（市）的红花大金元种植区采集典型黑胫病病株，用加有抗生素的黑麦A培养基分离纯化获得烟草疫霉菌株263个。

1.1.2  参考菌株  烟草疫霉已知A1交配型菌株991和A2交配型菌株38606分别由南京农业大学卵菌与真菌分子生物学实验室和荷兰瓦赫宁根大学植物病理实验室提供。

1.1.3  供试甲霜灵  供试96%甲霜灵原药由北京明德立达农业科技有限公司提供。

1.1.4  仪器设备  培养箱为LRH-250F生化培养箱，超净工作台为ZHJH-C1112B型超净工作台。

1.2  试验方法

1.2.1  交配型测定  交配型测定在10% V8培养基上进行。选取分离自大理州12个市县红花大金元不同种植烟区的150个供试菌株在V8平板上25 ℃黑暗培养7～10 d，用手术刀切取5 mm×20 mm菌丝条，待测菌株分别与A1和A2交配型参考菌株间隔20 mm进行对峙培养，25 ℃黑暗培养2周后，切取有对峙边界的菌块，显微观察是否有卵孢子形成。仅与A2交配型菌株配对产生卵孢子的定义为A1交配型，仅与A1交配型菌株配对产生卵孢子的为A2交配型，与A1和A2交配型菌株配对均不产生卵孢子的为A0交配型。

1.2.2  烟草疫霉对甲霜灵敏感基线的确定  96%甲霜灵原药用二甲基亚砜（DMSO，sigma）溶解配制成浓度为10 mg/mL的贮液，然后分别配制含甲霜灵0.0、1.0、2.0、3.0、5.0、10、15、20、30、50 mg/L系列浓度梯度的V8平板。选取分离自云南不同烟区的10个烟草疫霉菌株在V8平板上25 ℃黑暗培养7～10 d后用于后续的试验。用直径5 mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，菌丝面向下分别接到含不同浓度甲霜灵的V8平板上，每个处理重复3次，25 ℃黑暗培养3 d后用“十字交叉法”测量各处理菌落生长直径，根據菌落直径计算抑制率（%） =100×[（对照菌落直径-5）-（处理菌落直径-5）]/（对照菌落直径-5）。毒力回归曲线方程和EC₅₀值计算参照户艳霞等^[4]方法进行。

1.2.3  烟草疫霉对甲霜灵的敏感性测定  根据烟草疫霉对甲霜灵的敏感基线值，选取0.0、3.0、5.0、

10.0及20.0 mg/L等5个浓度梯度，采用含药平板法对259个大理州烟草疫霉菌株甲霜灵的EC₅₀值进行测定，明确大理州烟草疫霉对甲霜灵的抗药性水平。

2  结  果

2.1  大理州烟草疫霉的交配型组成

从2013—2014年大理州12个市县烤烟产区分离的烟草疫霉菌株中随机挑选了150个菌株进行交配型测定。结果显示，测定的150个菌株全部为A2交配型菌株，没有检测到A1交配型或者A0交配型，表明大理州烟草疫霉主要进行无性繁殖，有性生殖产生卵孢子在大理州烟草疫霉致病性和遗传多样性分化中的作用非常有限。

2.2  烟草疫霉对甲霜灵的敏感基线

挑取的10个云南烟草疫霉对甲霜灵的EC₅₀值

范围在1.9483～17.3122 mg/L，最不敏感菌株Pn1380与最敏感菌株Pn119对甲霜灵敏感性相差约8.9倍（表2），平均EC₅₀值为7.5183±0.0372 mg/L，表明云南烟草疫霉菌株对甲霜灵已有明显的抗性差异，甲霜灵对云南的烟草疫霉仍有一定的抑制作用，但已有抗药性菌株的产生，存在抗药性风险。根据测定的甲霜灵敏感性结果，将测定菌株的EC₅₀平均值7.5183 mg/L作为云南烟草疫霉菌株对甲霜灵的敏感基线。

2.3  大理州烟草疫霉对甲霜灵的敏感性

2013—2014年大理州不同烟区263个烟草疫霉菌株对甲霜灵的EC₅₀值分布于1.0829～33.6227 mg/L，最不敏感菌株是最敏感菌株的31.04倍，平均EC₅₀为8.7599±0.0358 mg/L，供试的263个烟草疫霉菌株对甲霜灵的EC₅₀值分布如图1所示。将EC₅₀<4.0 mg/L的菌株划归为敏感菌株，4.0 mg/L≤EC₅₀<10.0 mg/L之间的为中度抗性菌株，EC₅₀≥10.0 mg/L为抗性菌株。大理州不同红花大金元产区的烟草疫霉菌株对甲霜灵的敏感性有显著差异，敏感菌株39个占14.85%，中度抗性菌株139个占52.85%，抗性菌株85个占32.32%。其中大理、剑川、弥渡、祥云和云龙有敏感菌株分布，而抗性菌株主要分布在甲霜灵使用较多的大理、剑川、弥渡和洱源，中抗菌株为优势群体，在大理州各红花大金元产区均有分布。研究结果表明，由于长期使用甲霜灵锰锌防控烟草黑胫病，大理州各烟区烟草疫霉对甲霜灵的敏感性已经显著下降，中抗和抗性菌株广泛分布，甚至出现了高抗菌株，防控效果明显降低。

3  讨  论

异宗配合的疫霉菌通过亲和性的A1和A2两种交配型进行有性生殖，产生具有多层厚壁的卵孢子，可帮助病原菌在不适宜环境长期存活、顺利越冬，增大病原菌的初侵染源。而且有性生殖的过程，将产生具有更多遗传变异的重组后代，导致新的致病小种、强毒力或抗药性后代群体的产生，从而提高病原菌对寄主的致病性和寄生适合度，对抗病育种和病害防控造成严重的威胁^[5]。异宗配合疫霉菌A1和A2交配型分布对于确定田间病原菌群体的遗传变异和进化至关重要。国内外对不同寄主来源的烟草疫霉交配型研究发现，已知烟草疫霉存在A1、A2和A0三种交配型。多年前HO等^[10]、王革等^[11]曾报道烟草疫霉交配型在我国的分布规律总体呈均等趋势，华东和西南地区以A2交配型为主，华北和华南以A1交配型为主。马国胜等^[12]报道安徽省烟草疫霉以A2交配型占绝对优势，且在全省各烟区都有分布;其次为A0交配型，主要分布在安徽省固镇、凤阳等江淮老烟区;没有检测到A1交配型。孙常伟^[13]对重庆市烟草疫霉的研究结果与安徽省一致，A2交配型为主，其次为A0交配型，未检测到其他交配型。彭丽娟等^[14]报道贵州省烟草疫霉只存在A2交配型。CUI等^[15]报道了2013—2014年从河南省获得的32株烟草疫霉中31株为A2交配型，1株为A0，没有检测到A1交配型菌株。PARKUNAN等^[16]报道了2006—2008年从美国弗吉尼亚州分离获得的217株烟草疫霉中A2交配型菌株占94%，A1交配型占4%。该结果表明有性生殖不太可能是弗吉尼亚州烟草疫霉增强遗传多样性的主要机制。本研究测定的云南省大理州150个烟草疫霉菌株均是A2交配型，没有发现A1或A0交配型，表明大理州烟草疫霉主要进行无性繁殖，通过寄主残体或厚垣孢子成为初侵染源，有性生殖产生卵孢子在大理州烟草疫霉致病性和遗传多样性分化中的作用非常有限，大理州烟草疫霉的遗传多样性可能较低。本文交配型的研究结果也进一步证实，自然条件的烟草疫霉生活史中，卵孢子在引起黑胫病的作用方面可能并不如以前认为的那样重要，并且有性生殖产生新毒力后代出现的威胁可能被高估。最近，基于烟草疫霉基因组分析的微卫星（SSR）标记被成功开发用于群体遗传学分析^[17]，我们将对大理州烟草疫霉的遗传多样性进行研究，以便进一步为前述的无性繁殖推测提供遗传学证据。

甲霜灵是1977年由瑞士Ciba-Geigy公司推出的苯酰胺类杀菌剂，使卵菌引起的植物病害的化学防治水平得到划时代的提高。但是甲霜灵对病原菌的作用主要是抑制病原菌mRNA的合成，作用位点单一，长期使用很容易使病原菌发生突变，产生抗药性^[7]。美国早在1985年SHEW^[18]报道了种植烟草的田间连续几年施用甲霜灵，烟草疫霉群体对甲霜灵的敏感性下降，平均EC₅₀值逐年增大。1991年FERRIN等^[19]也报道从迎春花上分离到2株对甲霜灵产生自然抗性的烟草疫霉菌株，其EC₅₀值分别高达742.4和717.4 mg/L。PARKUNAN等^[16]报道2006—2007年美国弗吉尼亚州98%的烟草疫霉对5 mg/L的精甲霜灵敏感，2%的菌株中度敏感。王革等^[20]最早检测了95株云南烟草疫霉菌株对甲霜灵的敏感性，其EC₅₀值平均仅为0.0325 mg/L;袁宗胜等^[8]报道山东、安徽等地分离的21个烟草疫霉菌株对甲霜灵的EC₅₀值平均为0.2132 mg/L。李梅云等^[21]检测了云南省烟草疫霉菌株对甲霜灵的抗药性，34个菌株的EC₅₀值平均也仅为0.0148 mg/L。许学明等^[22]测定了来自云南、贵州、山东的38个烟草疫霉菌株EC₅₀值平均为0.2991±0.0843 mg/L。最近報道显示，广西烟草疫霉菌株对甲霜灵仍然敏感，EC₅₀值在0.0691～1.0243 mg/L;而贵州省则检测到甲霜灵抗性菌株，EC₅₀值分布范围为0.4192～20.4861 mg/L，平均EC₅₀值为3.3789 mg/L，最低抗药性水平与最高抗药性水平相差48.87倍^[23-24]。可以看出，随着甲霜灵使用年限增长，我国各烟区烟草疫霉菌株对甲霜灵的抗药性水平不断增高。本研究测定了2013—2014年大理州不同烟区263个烟草疫霉菌株对甲霜灵的敏感性，其EC₅₀值分布于1.0829～33.6227 mg/L，最不敏感菌株是最敏感菌株的31.04倍，平均EC₅₀为8.7599±0.0358 mg/L，显著高于国内其他烟区，比王革等^[20]最早检测的烟草疫霉抗药性水平增长了269.53倍。这说明在长期使用甲霜灵锰锌进行黑胫病防治的选择压力下，大理州各烟区烟草疫霉敏感性群体比例明显下降，中抗和抗性菌株在群体中的比例增高，且抗性菌株在大理州的分布亦有逐渐扩大的趋势，甲霜灵失效的风险较大。在今后烟草黑胫病的防控中应采用不同杀菌剂合理轮换施用，以避免长期单一地使用苯酰胺类杀菌剂对烟草疫霉造成的选择压力，烤烟生产中应加快其他新型高效安全替代杀菌剂的筛选和应用。

本研究首次從交配型、甲霜灵敏感性方面对大理州烟草疫霉的群体结构进行了分析，结果表明无性繁殖是大理州烟草疫霉维持群体遗传多样性和致病性的主要形式。大理州烟草疫霉已经对甲霜灵有较高水平的抗性，中抗和抗性菌株分布广泛。这些结果可为大理州和其他同类烟区烟草黑胫病的科学防控和抗病新品种培育提供理论指导。

4  结  论

大理州烟草疫霉群体结构单一，仅存在A2交配型，没有检测到A1和A0交配型，无性繁殖是该区域烟草疫霉维持群体遗传多样性和致病性的主要方式，有性生殖在大理州烟草疫霉新毒力类型和遗传分化中的作用非常有限;大理州烟草疫霉对甲霜灵的EC₅₀值分布于1.0829～33.6227 mg/L，平均为8.7599±0.0358 mg/L，以中抗菌株为优势群体，分布广泛;大理州烟草疫霉对甲霜灵已产生明显的抗药性，亟需开展抗药性治理和筛选新型高效安全的替代杀菌剂或生物制剂用于黑胫病的绿色防控。

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