苏 婕，谢心雨，李楚慧，贾玉飞，张思奇，韩得满

（台州学院 医药化工与材料工程学院，浙江 台州318000）

0 引言

汞在自然界中有三种存在形式，即元素汞（Hg）、无机汞（Hg+、Hg2+）和有机汞，各种形态的汞及其化合物都会对机体造成以神经毒性和肾脏毒性为主的多系统损害［1-2］。作为一种生活中常见的重金属元素，汞离子和甲基汞离子对人类健康和环境均具有极大的危害，因此，建立一种快速、简便和准确测定水中无机汞离子和甲基汞离子的分析方法具有重要意义［3-4］。

传统的汞离子检测方法主要有原子光谱法［5-6］、色谱法［7-8］、电化学分析法［9-10］和分光光度法［11-12］等，但是这些方法存在仪器昂贵、测定操作复杂、不易普及应用等问题，难以满足环境中无机汞和甲基汞分析的需求，因此，需要开发一种新型、简单、快速的无机汞和甲机汞的分析方法。

金铂纳米颗粒（PtAuNPs）是一种人工过氧化酶［13-14］，它能够催化双氧水和TMB 的反应，将无色的TMB 底物催化氧化生成蓝色的氧化态TMB［15］。而甲基汞和无机汞离子可以通过柠檬酸钠还原作用沉积在金铂纳米颗粒的表面，从而破坏了金铂纳米颗粒的过氧化酶作用。这就为我们通过观察其溶液颜色的变化，进而实现对无机汞和甲基汞的浓度检测提供了可能。与传统的分析方法相比，本方法不需要昂贵的分析仪器，也无需样品前处理，可以裸眼观察溶液颜色的变化判断无机汞和甲基汞离子的存在，再辅以分光光度计定量，可以实现水中痕量无机汞和甲基汞离子的可视化检测。

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

紫外-可见分光光度计Cary-60（安捷伦）；电子天平JM-83003（上海精天电子仪器有限公司）；恒温加热台（上海予申仪器有限公司）；透射电子显微镜Tecnai G2（FEI Tecnai）等。2-吗啉乙磺酸（MES）、TMB、氯金酸、氯铂酸、柠檬酸钠、硝酸汞、氯化铁、硝酸铜、硝酸银、氯化镉、氯化镁、氯化钠（上海晶纯试剂有限公司），以上试剂均为分析纯。

1.2 PtAuNPs的合成

按文献［15］的要求用柠檬酸钠还原法制备PtAuNPs：2.25 mL 的10 mmol/L HAuCl4，0.25 mL 的10 mmol/L H2PtCl6和100 mL 蒸馏水于置于250 mL 的锥形瓶中，磁子搅拌，持续加热溶液至沸腾，然后加入3 mL1%的柠檬酸钠溶液，再搅拌30 min 可以得到深红色的PtAuNPs 溶液。

图1 金铂合金纳米颗粒的制备方法及无机汞和甲基汞检测示意图Fig.1 Schematic representation of the preparation of the PtAuNPs for the detection of mercury ions

1.3 溶液制备及光谱测试

1.3.1 3，3"，5，5"-四甲基联苯胺（TMB 溶液）和MES 缓冲溶液的制备

用分析天平准确称量化合物TMB 0.2884 g TMB 于10 mL 烧杯中，加入5 mL 二甲亚砜溶解，将溶液转移后的试剂瓶定容至8 mL 后，即得到15 mmol/L 的TMB 溶液。

称取MES（2-吗啉乙磺酸）0.24405 g 于100 mL 烧杯中，用2 mol/L 的氢氧化钾溶液调节pH 至4.5。将溶液转移至50 mL 容量瓶中定容即可得到50 mL 25 nmol/L 的MES 缓冲溶液。

1.3.2 TMB-H2O2 体系中PtAuNPs 浓度的优化（以下光谱测试均使10 mm×10 mm 比色皿）

取5 支1 mL 离心管，加入20 μL H2O2，20 μL TMB 溶液，依次加入5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，25 μL PtAuNPs，加入MES 缓冲溶液定容至2 mL，反应10 min，用紫外-可见分光光度计测定反应后体系的吸收曲线以及650 nm 处吸光度。

1.3.3 比色体系加入不同浓度的Hg2+的紫外-可见光谱滴定曲线的测定

为了考察Hg2+浓度离子对PtAuNPs 催化活性的影响，在H2O2-TMB 反应体系中，加入不同量的Hg2+溶液，Hg2+最终浓度（μmol/L）分别为：0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0。用紫外-可见分光光度计测定体系吸收曲线以及650 nm 处吸光度。

1.3.4 比色体系对各种干扰离子选择性的测定

为了考察不同金属离子对PtAuNPs 催化活性的影响，在H2O2-TMB 反应体系中，选择加入常见的金属离子溶液，包括Hg2+，Cd3+，Mg2+，Fe3+，Ag+，Cu2+，K+，Zn2+，Pb2+离子的最终浓度为1 μmol/L，用紫外-可见分光光度计测定体系吸收曲线以及650 nm 处吸光度。

2 结果与讨论

2.1 PtAuNPs的合成表征

如图1PtAuNPs 的合成路线所示，加入柠檬酸钠、氯金酸和氯铂酸一锅法制备，所得深红色PtAuNPs胶体溶液，进行透射电镜表征如图2 所示，纳米颗粒的粒径为13 nm。

图2 PtAuNPs 透射电子显微镜图Fig.2 TEM photograph of PtAuNPs

2.2 PtAuNPs的表征

将比色体系中加入的PtAuNPs 的体积优化，按照1.3.2 所述方法进行反应。反应过程参数：分别加入5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，25 μL PtAuNPs，反应10 min。如图3 所示，随着PtAuNPs 的增加，体系在650 nm 处的吸光度值一直增加。当加入25 μL PtAuNPs 纳米颗粒时，吸光度最大。因此，选取加入25 μL PtAuNPs 作为最优的条件，后续实验采取加入25 μL PtAuNPs 来进行无机汞和甲基汞的测定。

图3 加入不同体积的PtAuNPs 对催化氧化TMB 的影响Fig.3 Peroxidase-like activity of Pt/Au with different concentrations of PtAuNPs in the colorimetric reaction of TMB in the presence of H2O2

2.3 无机汞离子和甲基汞离子的检测

我们通过检测不同浓度的Hg2+和CH3Hg+来确定比色方法的灵敏度和线性范围。随着Hg2+和CH3Hg+浓度的提高（0～1 μM），比色体系（TMB-H2O2）的吸光度逐渐降低（如图4A 和图5A 所示）。这是因为Hg2+和CH3Hg+通过PtAuNPs 胶体溶液中的柠檬酸钠还原作用沉积到PtAuNPs 表面，破坏了PtAuNPs 的过氧化酶的催化作用。这样TMB-H2O2的比色反应体系就被破坏，引起了传感体系吸光度的降低。我们可以用传感体系的吸光度来定量Hg2+和CH3Hg+的浓度。如图4B 和图5B 所示，650 nm 处的吸光度比例变化值与Hg2+和CH3Hg+的浓度呈线性关系。线性方程分别为Y=0.0128+0.0635 CHg2+和Y=0.039+0.0541CHg2+。检出限（LOD）根据公式LOD=3 σ/slope 计算为56.9 nmol/L（Hg2+）和61.3 nmol/L（CH3Hg+）。该结果可以应用于无机汞和甲基汞的多重检测。

图4 无机汞离子的灵敏度测试（A） UV-vis absorption spectra of the supernatant solution for TMB-H2O2 reaction against various concentrations ofHg2+ ranging from 0-1 μmol/L；（B） Linear curve of absorbance value at 650 nm versus the Hg2+concentrationFig.4 Sensitivity for Hg2+ detection

图5 甲基汞离子的灵敏度测试（A） UV-vis absorption spectra of the supernatant solution for TMB-H2O2 reaction against various concentrations ofCH3Hg+ ranging from 0-1 μmol/L；（B） Linear curve of（A0-Ai）/A0 at 650 nm versus the CH3Hg+ concentrationFig.5 Sensitivity for CH3Hg+ detection

2.4 无机汞离子和甲基汞离子的选择性检验

我们使用无机汞、甲基汞和其他不同种类的金属离子溶液对比色传感器的选择性进行了测试，所有金属离子的浓度均为1.0 μmol/L。相同实验条件下的测试结果如图6 所示。从图中可以看出，加入无机汞和甲基汞的两组吸光度变化值要远大于加入其它金属离子的几组。这是因为其他金属离子不会破坏PtAuNPs 的过氧化酶活性，阻碍TMB 和H2O2的催化反应。结果说明比色传感器对Hg2+和CH3Hg+具有较高的选择性，可用于水中Hg2+和CH3Hg+离子的选择性检验。我们还测试了各共存离子的干扰上限值，尝试使用10 倍浓度的共存离子进行测试，发现除了Cd2+以外的离子均无影响，Cd2+的干扰较大。因此其他共存离子的上限为10 μmol/L，Cd2+为1 μmol/L。

图6 Hg2+和CH3Hg+的选择性测试：当溶液中存在着1.0 μmol/L的不同金属离子时在650 nm 处的吸光度比例变化值的柱状图Fig.6 Selectivity for Hg2+ and CH3Hg+detection：Histogram of（A0-Ai）/ A0 at 650 nm of the supernatant solution for TMB-H2O2 reaction in the presence of different ions

2.5 水样中无机汞离子和甲基汞离子的测定

为了检验传感体系在实际水样中的应用能力，实验选择海水和湖水作为样品本底。将水样用滤纸过滤后，测定2 个水样中的无机汞和甲基汞，并对其进行加标回收实验，回收率在95%～105%之间，证明本检测体系可以用于环境水样中无机汞和甲基汞的准确检测。

表1 环境水样中无机汞和甲基汞的分析结果Table 1 Analytical results of inorganic mercury and methylmercury in the environmental water samples

3 结论

本研究提出了一种简单、高效的水样中无机汞和甲基汞离子的检测方法。该方法基于无机汞和甲基汞离子在体系中被柠檬酸钠还原沉积于金铂纳米颗粒表面，从而破坏了金铂纳米颗粒的过氧化酶活性，导致TMB-H2O2催化体系被破坏。我们可以通过监测比色反应中溶液颜色的变化，来定量无机汞和甲基汞离子的浓度。该方法的检出限为56.9 nmol/L（Hg2+）和61.3 nmol/L（CH3Hg+）。与其它传统的汞离子检测方法相比，本方法具有灵敏度高、选择性好、简单快速的优点，且无需昂贵的分析仪器和前处理手段，就可以实现对环境中水样的高灵敏检测。