蒋鹏飞，王 英，潘 坤，彭 俊，徐 剑＊＊，彭清华1,＊＊

（1.湖南中医药大学 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007；3.中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室 长沙 410208）

视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa，RP）是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜疾病，根据不同的遗传学方法，视网膜色素变性可以分为常染色体显性[1]、常染色体隐性[2]、X连锁[3]等。视网膜色素变性在世界各国的发病率在1/5000-1/3000之间，是最常见的遗传性危害眼底致盲的眼病之一。大多数视网膜色素变性患者在青少年时期发病，发病时隐匿，主要临床特征为夜盲、进行性视野缺损、眼底的特征性改变以及视网膜电图（electroretinogram，ERG）异常[4]，晚期仅残留中央管状视野，严重影响患者生活质量，若不及时治疗，病情将持续发展[5]。大多数学者认为RP的视力损伤机制与视网膜感光细胞的凋亡有关[6]。本研究以经典模型鼠视网膜色素变性皇家外科学院(Royal College Surgeons，RCS)（rdy-/,p-/-）大鼠为研究对象，通过观察益气明目丸对RCS（rdy-/,p-/-）大鼠视网膜各层结构、凋亡相关基因Bcl-2相关X蛋白（Bcl2-Associated X protein，Bax）mRNA与天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase-3）mRNA的表达的影响，探讨益气明目丸治疗RP的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级1.5月龄RCS大鼠24只（质量合格证号：NO.201614068，苏州昭衍新药研究中心有限公司），体重75-130 g，其中16只RCS(rdy-/-，p-/-）大鼠，8只RCS（rdy+/+,p+/+）大鼠，两种大鼠均雌雄各半，饲养在湖南中医药大学实验楼动物实验中心SPF级实验房，湿度50-55%，室温23±2℃，自由进食进水，每3-4天更换一次垫料。本研究中使用的RCS(rdy-/-，p-/-）大鼠为已造模成功（视网膜色素变性大鼠模型）的大鼠，无需再次造模。

1.2 主要仪器设备和手术器材

电泳仪（北京六一仪器厂）、轮转石蜡切片机（徕卡）、数码医学图像分析系统（深圳市沅恒科技有限公司）、-80°超低温冰箱（中科美菱）、立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、净化工作台（苏州净化设备有限公司）、电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、低温台式高速离心机（赫西仪器装备有限公司）、超微量分光光度计（美国nanodrop）、PCR仪（德国Biometra）、凝胶成像系统（美国Bio-Rad）、微量移液器（德国eppendorf）、垂直板电泳槽（北京六一仪器厂）、台式高速冷冻离心机（Thermo）、水平电转槽（北京六一仪器厂）、超纯水仪（millipore公司）、紫外可见分光光度计（上海spectrum公司）、恒温摇床（金坛）、水平摇床（北京六一仪器厂）、压片夹（koda）、扫描仪（日本Canon）。

1.3 主要药品和试剂

益气明目丸（湖南中医药大学第一附属医院药剂科，湘药制字Z20080745）由党参10 g、黄芪15 g、白术10 g、菟丝子15 g、山药10 g、茯苓10 g、黄精15 g、北柴胡10 g、葛根10 g、丹参15 g、当归10 g、三七粉7 g、甘草3 g组成，按现代制剂工艺制成小丸剂，每瓶120 g。

水合氯醛（湖南中医药大学病理实验室，国药准字H37022673）、Harris苏木素（湖南中医药大学病理实验室，批号：71020784）、PV9000型二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司，批号：zb-5301）、细胞裂解液（江苏碧云天，批号：P0013）、RIPA蛋白裂解液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G2002）、ECL发光试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G2014）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天，批号：P0006）、脱脂奶粉（伊利公司，批号G5002）、转移缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司，G2017）、羊抗兔二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GB23303）。

2 实验方法

2.1 分组方法

将8只RCS（rdy-/,p-/-）公鼠依次编为1-8号，通过随机数字表法：从随机数字表第3行第5个数开始抄录8个数（84、51、67、47、97、19、98、40），令单数划入模型组，双数划入益气明目丸组，随机分为2组：模型组公鼠（4只）和益气明目丸组公鼠（4只）；将8只RCS（rdy-/,p-/-）母鼠依次编为9-16号，同样方法分为2组：模型组母鼠（4只）和益气明目丸母鼠（4）只，使模型组与益气明目丸组大鼠雌雄各半。空白组：RCS（rdy+/+,p+/+）大鼠（8只）。

2.2 干预方法及疗程

大鼠购回后予适应性饲养1周后进行灌胃，灌胃时间为30天，每日灌胃一次，灌胃药物为益气明目丸。按照“人-动物体表面积等效剂量比值表”折算实验动物的给药剂量，折算公式：W*成人用量（g）/动物体重（kg），折算系数W=0.018，每组灌胃药物详情如下：模型组和空白组的灌胃药物为0.9%生理盐水，其剂量按照12 mL/kg·d计算；益气明目丸组的灌胃药物为益气明目丸悬浊溶液，灌胃剂量按7.8 g/·kg-1的混悬液（0.156 g·mL-1）计算。溶液配制方法为相当于7.8 g益气明目丸粉末与50 mL灭菌蒸馏水混合，室温摇匀。每日灌胃一次。实验过程中对动物的处置符合2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

2.3 取材方法

于灌胃第30天结束后第1天取材。用10%水合氯醛3.5 mL·kg-1腹腔注射麻醉，麻醉满意后，迅速摘取两只眼球，断颈处死老鼠。从每组RCS大鼠眼球中选取一只眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，备行HE染色和免疫组化检测。剩下另只眼球置于冰块上，在显微镜下用眼科显微器械仔细去除眼前节及玻璃体等多余组织，小心分离视网膜组织后，将其置于EP管内，保存于-80℃冰箱中，备行WB及PCR检测BaxmRNA、Caspase-3mRNA的表达。

表1 引物序列表

表2 加入试剂名称及数量

表3 加入冷却反应液中的试剂及数量

2.4 指标检测

2.4.1 HE染色观察标本视网膜各层结构的形态学变化

经脱水浸蜡、二甲苯溶液脱蜡、无水乙醇洗蜡、乙醇浸泡、自来水洗、苏木素染色、乙醇盐酸分色、伊红染色、乙醇分色脱水、二甲苯溶液透明、中性树胶封片等步骤，在光学显微镜下观察并拍照。

2.4.2 RT-qPCR法检测RCS大鼠视网膜BaxmRNA、Caspase-3mRNA的表达

（1）参照Gene Bank数据库中各目的基因的序列下载基因序列，用primer premier 6.0进行引物设计，设计的引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，具体引物序列如表所示（表1）；（2）提取总RNA：①处理实验器皿：浸泡、高温高压灭菌；②总RNA的提取：匀浆、离心、去上清液、晾干、入DEPC水溶解RNA；③等到RNA沉淀完全溶解后，用凝胶电泳进行检测，放在-20℃的环境中保存。（3）测RNA浓度与纯度；（4）逆转录cDNA：①解冻反应液，混匀，离心，置于冰上；②在冰上进行下述操作：往预冷的200 μL离心管（RNasefree）中加入以下试剂（表2）；③混匀，离心，42℃温浴10 min，冷却；④将以下试剂加入冷却的反应液中（表3）；⑤混匀上述④中反应液，42℃，温浴1小时；⑥85℃5 min，-20℃保存，备用。（5）PCR检测。

2.4.4 Western blot法检测RCS大鼠视网膜Bax、Caspase-3的相对表达量

（1）制备蛋白样品；（2）Bradford 法测定蛋白质含量；（3）SDS-PAGE凝胶电泳；（4）转膜；（5）抗体孵育和显色；（6）凝胶图像分析。

2.5 统计学处理

实验数据以均数±标准差（xˉ±s）表示。统计学分析采用SPSS23.0进行正态性和方差齐性检验，符合正态性和方差齐性则进行单因素方差分析（one way ANOVA）。P＜0.05表示差异具有显著性，P＜0.01表示差异具有极显著性。

3 结果

3.1 各组RCS大鼠视网膜组织HE染色结果

空白组：大鼠视网膜色素上皮层、视杆视锥层、外核层、外从状层、内核层、内从状层、神经节细胞层、神经神经纤维层等各层结构清晰正常（图1）。

模型组：大鼠视网膜的厚度显著薄于空白组RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠。其主要病灶位于外层视网膜，视细胞萎缩变性。HE染色可见的视网膜色素上皮细胞不连续并大部分损失。视网膜的外层较薄，部分感光细胞形态欠规则，且细胞核数量减少，大部分区域无外感光器核染色，一小部分区域可见聚集成团的细胞核染色。并有少量的点状黑色素颗粒散在视网膜内层（图2）。

图1 空白组(HE×400)

图2 模型组(HE×400)

图3 益气明目丸组(HE×400)

益气明目丸组：大鼠视网膜厚度明显高于模型组，并且可以见到一部分视网膜色素上皮。可以看出，该组感光细胞核的数量大于模型组的数量，外从状层、外核层、视杆视锥层的结构厚于模型组清晰，并且结构更清晰(图 3)。

3.2 各组RCS大鼠视网膜Bax、Caspase-3的mRNA表达情况

各组视网膜组织中检测指标BaxmRNA相对表达量模型组与空白组比较有极其显著性差异（P＜0.01），益气明目丸组与空白组比较有显著性差异（P＜0.05），益气明目丸组与模型组比较有极其显著性差异（P＜0.01）；各组视网膜组织中检测指标Caspase-3mRNA相对表达量模型组与空白组比较有极其显著性差异（P＜0.01），益气明目丸组与空白组比较无显著性差异（P＜0.05），益气明目丸组与模型组比较有极其显著性差异（P＜0.01）（图4）。

以上结果表明益气明目丸组BaxmRNA、Caspase-3mRNA相对表达量均较模型组减少，且与空白组接近，通过给RCS（rdy-/,p-/-）大鼠灌胃益气明目丸在一定程度上抑制了其BaxmRNA、Caspase-3mRNA的相对表达。各组PCR检测结果与Bax、Caspase-3mRNA检测结果见图5。

3.3 各组RCS大鼠视网膜WB检测Bax、Caspase-3的蛋白表达情况

各组视网膜组织中检测指标Bax蛋白相对表达量模型组与空白组比较有极其显著性差异（P＜0.01），益气明目丸组与空白组比较有极其显著性差异（P＜0.01），益气明目丸组与模型组比较有极其显著性差异（P＜0.01）；各组视网膜组织中检测指标Caspase-3蛋白相对表达量模型组与空白组比较有极其显著性差异（P＜0.01），益气明目丸组与空白组比较无显著性差异（P＞0.05），益气明目丸组与模型组比较有极其显著性差异（P＜0.01）（图6）。

以上结果表明益气明目丸组Bax蛋白、Caspase-3蛋白相对表达量均较模型组减少，且与空白组接近，通过给RCS（rdy-/,p-/-）大鼠灌胃益气明目丸在一定程度上抑制了其Bax蛋白、Caspase-3蛋白的相对表达。各组WB检测结果与Bax、Caspase-3蛋白相对表达量检测结果见图7。

4 讨论

图4 视网膜组织Bax mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量

图5 PCR检测结果

图6 视网膜组织中Bax、Caspase-3蛋白相对表达强度

图7 Western blot检测结果

中医将视网膜色素变性归为“高风内障”的范畴，并认为虚是视网膜色素变性发生的主要原因，或肾阳虚亏，命门火衰；或肝肾两亏，精血不足，阴阳不济，阳气不能为用；或脾胃虚弱，清阳不升，浊阴上盛，阳不彰明；或气血不足等。RP的主要发病机制为本虚标实，虚中夹瘀，且血瘀贯穿视网膜色素变性的始终[7-8]。李传课教授基于此病机根据滋补肝肾、活血明目的治疗法则创立了治疗视网膜色素变性的的纯中药制剂——益气明目丸，在临床上治疗虚中夹瘀型的RP取得了一定的疗效。

益气明目丸中党参、黄芪、白术、山药、茯苓、黄精健脾补虚，益气明目；山药、黄精、菟丝子既可补脾，又可补肾，久服聪耳明目；柴胡助补益药升举清阳，上达于目；当归、丹参养血活血以化瘀；葛根可助柴胡升举脾胃之清气，又因葛根含黄酮苷，现代研究认为其能扩血管，增加血流，用此以助当归、丹参加强活血化瘀，改善微循环，增加局部营养，以提高视网膜功能。诸药合用，共奏补脾益气、活血明目之功。

已有研究证实：视网膜色素变性RCS（rdy-/,p-/-）大鼠具有“虚中夹瘀”证候[9]，本实验则以该种遗传性RCS大鼠作为研究对象，在益气明目丸组经过30天灌胃治疗后，视网膜各层组织结构、视网膜厚度均高于模型组，Bax、Caspase-3的mRNA表达、蛋白相对表达也明显低于模型组，表明益气明目丸可抑制Bax、Caspase-3等凋亡相关基因的mRNA表达，进而抑制视网膜感光细胞的凋亡。

视网膜感光细胞能将视觉信号转换为光能信号，是传送视觉信息的第一级神经元，在视觉形成中占据着举足轻重的地位[10]，细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主有序死亡的过程，它由基因控制，并分为起始、效应器、凋亡执行三个阶段，各个阶段的完成也受到相关基因的激活、表达以及调控等[11]。视网膜中的感光细胞很脆弱，随着人造光源的污染增加以及来自外界环境的光刺激都极易引起感光细胞损伤，而感光细胞一旦受损，便无法再生[12]。感光细胞的凋亡是RP病程的最终结局，所以通过有效的方法延缓或者抑制视网膜感光细胞的凋亡是治疗RP的关键所在。

Bax属于Bcl-2家族众多成员之一，当外界刺激诱导凋亡时，Bax在受到死亡信号的刺激后被激活，从细胞质中转移到线粒体膜上与膜结合，并快速形成同源二聚体，促进细胞凋亡[13]。Caspase是存在于细胞质中的蛋白酶，它参与细胞的生长、分化与凋亡调节各个环节，并且与真核细胞的凋亡有着密不可分的关系，但是只有在Caspase活化以后才能发挥其促凋亡的作用。Caspase的活化是细胞凋亡的过程中一个多步水解并且有序进行的过程，包括了同源、异源活化。异源活化是凋亡蛋白酶的酶原被活化的经典途径，它是由一种Caspase活化另一种Caspase。而Caspase-3就是被异源活化的Caspase之一，能够直接促发细胞凋亡[14]。多年以来，Caspase-3的这一促凋亡作用已被国内外多项研究证实[15-19]。

综上所述，益气明目丸可抑制BaxmRNA、Caspase-3mRNA的相对表达，从而抑制了RP的感光细胞的凋亡，改善视网膜超微结构，改善了视功能，这可能是益气明目丸治疗RP有效的可能机制之一。