陶晓峰 刘畅 付明杰 白艳 孟津伊 宋波

大连市中心医院1病理科，2风湿免疫科（辽宁大连116033）；3大连医科大学病理教研室（辽宁大连116044）

膀胱癌又称为浸润性尿路上皮癌（infiltrating urothelial carcinoma），其发病率位列我国男性恶性肿瘤的第7位。分为非肌层浸润性膀胱癌（non⁃muscle⁃invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润 性 膀 胱 癌（muscle⁃invasive bladder cancer，MIBC），75%～85%的患者在确诊时处于Ta～T1期［1］。然而NMIBC复发率高，且10% ～20%的Ta～T1期膀胱癌最终会进展为 MIBC［2］。尽管NMIBC的5年生存率高达88%～98%，但是发生肌层浸润后其生存率可下降至63%。目前的膀胱癌治疗监测主要包括膀胱镜检查和尿液细胞学，但是仍有可能漏诊乳头瘤和原位癌［3］。目前为止除了尿液细胞学以外，缺乏很好的无创检查方法［4］。

Fibulin⁃3，也叫 EFEMP1（epidermal growth fac⁃tor⁃containing fibulin⁃like extracellular matrix protein 1），是一种细胞外基质糖蛋白，在体内广泛表达，上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等各种细胞都能够表达和分泌Fibulin⁃3，Fibulin⁃3定位在密集间充质和上皮及内皮细胞基膜［5］。Fibulin⁃3在细胞外基质中具有构架作用，另外还能够活化下游信号通路，比如表皮生长因子受体［6］。与研究广泛的Fibulin⁃1和Fibulin⁃2相比，对Fibulin⁃3的功能仍知之甚少。Fibulin⁃3在多种实体肿瘤中异常表达，Fibulin⁃3既是肿瘤促进因子，也是肿瘤抑制因子，但是其在膀胱癌中的相关研究较少。本研究将探讨Fibulin⁃3在膀胱癌组织中的表达情况及其与肿瘤分期及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本收集60例膀胱癌石蜡包埋标本选自2008年至2016年于大连市中心医院手术治疗的膀胱癌患者，患者均有完整的病历记录和病理资料，病理诊断均为浸润性尿路上皮癌；年龄39～81岁，中位年龄62岁。正常对照选取距离肿瘤组织0.5 cm以上的膀胱组织。根据患者的相关临床信息进行分组（性别、年龄、有无转移、浸润深度、分化程度、临床分期、是否复发）。

1.2 抗体与实验方法Fibulin⁃3单克隆抗体购自Santa Cruz公司。二抗购自迈新公司。采用免疫组织化学的方法，检测膀胱癌及正常膀胱组织中Fibulin⁃3的表达。

1.3 结果判断Fibulin⁃3定位细胞核，呈棕色颗粒。免疫组化结果的判读标准参考陶晓峰等［7］和CHEN等［8］的标准。

1.4 统计学方法采用行×列χ2检验（SPSS 18.0软件）；P＜0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌中Fibulin⁃3的表达Fibulin⁃3定位在细胞核，呈棕色颗粒状，从局部或灶性至弥漫性均有，癌旁正常膀胱组织很少见阳性表达，阳性表达以灶性为主（图1～4）。Fibulin⁃3在膀胱癌中的阳性表达率高于癌旁正常膀胱组织（P＜0.01）。见表1。

图1 膀胱癌中Fibulin⁃3阴性表达（SP法×200）Fig.1 Negative expression of Fibulin⁃3 in bladder cancer sample

图2 膀胱癌中Fibulin⁃3局灶弱表达（SP法×200）Fig.2 Low expression of Fibulin⁃3 in bladder cancer sample

图3 膀胱癌中Fibulin⁃3弥漫中度表达（SP法×100）Fig.3 Moderate expression of Fibulin⁃3 in bladder cancer sample

图4 膀胱癌中Fibulin⁃3强表达（SP法×200）Fig.4 High expression of Fibulin⁃3 in bladder cancer sample

表1 膀胱癌和正常膀胱组织中Fibulin⁃3的表达Tab.1 Expression of Fibulin⁃3 in bladder cancer sample and normal bladder tissues 例（%）

2.2 膀胱癌中Fibulin⁃3的表达与临床因素的关系Fibulin⁃3在侵及肌层、伴有转移、Ⅲ～Ⅳ期膀胱癌和复发的膀胱癌中阳性表达率分别高于未侵及肌层、无转移、Ⅰ～Ⅱ期和无复发的膀胱癌，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而与性别、年龄和分化程度之间未见明显差异，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 膀胱癌中Fibulin⁃3的表达与临床因素的关系Tab.2 Correlation between Fibulin⁃3 and clinical characteristics in bladder cancer patients 例

3 讨论

Fibulins是细胞外基质糖蛋白家族成员，由一串钙结合表皮生长因子（calcium⁃binding epidermal growth factor）样模块和C端fibulin样结构域组成。Fibulins主要参与构成细胞外基质，该家族已知有7个基因型，其中Fibulin⁃3是调控细胞的生长及信号转导的重要因子，并参与肿瘤的发生与演进。本实验表明，Fibulin⁃3在膀胱癌组织中高表达，并且与肿瘤浸润、转移、分期及复发相关。以往研究证实，Fibulin⁃3在神经胶质瘤、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌中呈过表达，并与肿瘤进展和不良预后有关；而在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、鼻咽癌中Fibulin⁃3下调，由于其启动子的超甲基化，这个超甲基化过程与肿瘤进展及不良预后有关［9］。Fibu⁃lin⁃3在不同肿瘤中发挥相反作用的机制尚不明确，可能与其调控基质金属蛋白酶（matrix metallo⁃proteases，MMPs）、血管生成、上皮间充质转化以及MAPK、AKT、NOTCH等信号通路有关［10⁃11］。

本研究发现Fibulin⁃3升高与膀胱癌浸润转移相关，与以往一些研究结果一致。国外学者对159例宫颈癌患者进行分析，发现Fibulin⁃3的表达与肿瘤组织的微血管密度（microvascular density，MVD）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的基因水平呈显著相关，过表达Fibulin⁃3与患者的淋巴结转移情况、血管侵袭和生存率下降显著相关，多变量分析显示Fibulin⁃3是宫颈癌不良预后的独立危险因素［7］。在卵巢癌中同样证实Fibulin⁃3呈高表达并与MVD和VEGF相关，组织和血清中的Fibulin⁃3过表达与临床分期、低分化、淋巴结转移及不良预后正相关［8］。HU等［12］发现升高的Fibulin⁃3与胶质瘤侵袭有关，在胶质瘤组织和体外培养的胶质瘤细胞中Fibulin⁃3均呈现高表达，而在正常脑组织和培养的星形胶质细胞中则检测不到Fibulin⁃3蛋白，过表达和敲除Fibulin⁃3并未影响胶质瘤细胞的形态或增殖，但是增加了底物特异性细胞黏附，促进了器官培养环境中的细胞运动和扩散。过表达Fibulin⁃3的肿瘤组织和体外培养胶质瘤细胞中，MMPs（包括 MMP⁃2/MMP⁃9 和 ADAMTS⁃5）的表达及活性明显增加，提示Fibulin⁃3参与肿瘤发展过程可能与MMPs有关。在胰腺癌中，DNA微阵列杂交实验显示，与人胰腺癌细胞系FG细胞相比，Fibulin⁃3的表达在胰腺癌高转移性细胞株L3.6pl细胞中明显增加；同时在体内实验中将Fibulin⁃3转染给FG细胞促进了原位和转移肿瘤的生长，Fibulin⁃3促进了肿瘤细胞生成VEGF并增加了CD31+微血管，而并未改变内皮细胞增殖和迁移，提示Fibulin⁃3具有间接的血管生成作用［13］。此外，在给予化疗药物吉西他滨、5⁃氟尿嘧啶和伊立替康时，Fibulin⁃3减少了肿瘤细胞凋亡并促进了细胞周期进程，提示升高的Fibulin⁃3与肿瘤耐药有关［13］。最新研究证实，Fibulin⁃3的表达水平在MIBC中显著高于NMIBC，同时在几个膀胱癌细胞系中Fibulin⁃3均被证实与肿瘤浸润有关，给膀胱癌小鼠模型敲除Fibulin⁃3明显降低了MIBC的发生率［9］。

在另一些研究中，Fibulin⁃3则被证实能够抑制肿瘤进展。TIAN等［14］研究证实，Fibulin⁃3作为乳腺癌微环境中的一种分泌性蛋白，能够有效抑制乳腺癌细胞和内皮细胞的转移生长因子β（trans⁃forming growth factor⁃β，TGF⁃β）通路，Fibulin⁃3与TGF⁃β受体I相互作用，阻断了TGF⁃β诱导的TGF⁃β受体I与TGF⁃β受体II结合，进而阻断了下游TGF⁃β信号通路；同时在乳腺癌进展过程中，Fibu⁃lin⁃3表达减少，低水平Fibulin⁃3与疾病不良预后相关，升高的Fibulin⁃3能够抑制TGF⁃β诱导的上皮间充质转化、迁移、浸润和内皮通透性，而Fibu⁃lin⁃3缺失则能够促进TGF⁃β介导的这些效应，证实Fibulin⁃3是乳腺癌微环境中的一种新的TGF⁃β信号通路抑制剂。XU等［15］研究发现，肺癌组织的Fibulin⁃3基因和蛋白水平均显著低于正常组织，下调肿瘤组织的Fibulin⁃3基因水平会增加Fibulin⁃3启动子甲基化，患者的血清Fibulin⁃3水平与癌症进展、生存率及循环肿瘤细胞数量密切相关；此外将肺癌A549细胞转染到Fibulin⁃3载体上，发现表达Fibulin⁃3的肺癌A549细胞增殖率和迁移率显著降低。研究证实Fibulin⁃3可通过抑制细胞外信号调节激酶，活化糖原合酶激酶3β，抑制Wnt/β⁃catenin信号，进而诱导肺癌细胞中与癌症浸润相关的启动子的MMP⁃7表达［16］。

SIMSEK等［17］对80例结肠癌患者进行研究，发现结肠癌患者术前血清Fibulin⁃3水平较对照组相比显著减低，提示其可能作为结肠癌的一种血清标记物。Fibulin⁃3也被认为是未来诊断恶性间皮细胞瘤的生物标志物之一［18］。

总结本研究证实，膀胱癌中Fibulin⁃3呈高表达，并与膀胱癌的发生、侵袭和转移有关，可作为反应膀胱癌生物学行为和判断预后的有效指标。