祝丽琼 陈慧 刘梅兰 陈颖 王瞾华 魏菁 苏芳 张建平

中山大学孙逸仙纪念医院1妇产科，2医学研究中心（广州 510120）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是常见的妊娠并发症，指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上自然流产者。据统计，RSA的发病率约5%，它在生理和心理上对育龄妇女及其家庭产生诸多不良的影响，严重损害人类生殖健康。RSA的病因非常复杂，包括夫妇或胚胎染色体异常、代谢及内分泌异常、感染，生殖道解剖异常、抗凝脂综合征等［1］。但仍有一半以上患者病因不明，因此称为“原因不明复发性流产”（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。生殖免疫学观点认为，URSA的发生与母-胎免疫耐受异常有关［2］。近年来，CD4+CD25+调节性T细胞（regula⁃tory T cell，Treg）在免疫耐受中的作用备受关注，Treg细胞在正常妊娠的维持中具有重要作用［3］。既往对Treg细胞的研究较多采用CD4+CD25+或CD4+CD25high作为其分子标志［4］，但这标记并不能真实反映Treg细胞水平。Foxp3又称叉状头转录因子，在Treg细胞中特异性表达，是Treg细胞特异性的分子标志。本研究采用CD4、CD25、Foxp3作为标记，采用三色流式细胞技术检测并比较正常未孕及早孕，URSA患者未孕及稽留流产外周血中Treg细胞百分比，Foxp3 mRNA表达及血清中细胞因子TGF⁃β及IL⁃10的表达，以探讨Treg细胞数量及其功能在URSA患者中的变化及其在妊娠维持中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2013年9月至2015年1月在中山大学孙逸仙纪念医院就诊，有连续3次或3次以上12周以前发生流产史的URSA稽留流产者及未孕患者各50例作为研究组，稽留流产患者在入组时均以阴道B超确诊为早期妊娠稽留流产，且经过系统流产病因筛查，排除夫妇染色体异常、内分泌异常、解剖异常、感染及抗磷脂综合征导致的流产；选取同期在人流室就诊，要求进行人工流产的早期妊娠者25例及在体检中心体检的正常未孕妇女25例作为正常对照组，所有对照者以往至少有过一次正常足月分娩且无自然流产病史，正常早期妊娠者入组时均以B超确诊为宫内早孕，可见心管搏动。所有研究对象均没有吸烟史、酗酒史、无糖尿病、高血压、心脏病、肝肾疾病及血液疾病，3个月内均无疫苗接种史。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂淋巴细胞分离液购自Sigma公司，流式抗体：CD4⁃FITC，CD25⁃APC、Foxp3⁃PE及PE同型对照单克隆抗、固定剂、破膜剂均购自BD Pharmigin公司。qRT⁃PCR引物由广州吉赛生物技术有限公司设计合成。Trizol购自美国Invitrogen公司，Real⁃time PCR试剂购自盒日本TOYOBO公司，反转录试剂盒购自美国Promega公司。细胞计数仪为Beck⁃man coulter（美国），PCR仪购自美国ABI公司，流式细胞仪购自BD公司（BD FACS Verse ⁃Z6511550198）。

1.2.2 分离外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cell，PBMC）本研究通过中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准，在征得研究对象的知情同意后，使用肝素钠试管抽取静脉血4 mL（研究组在行清宫前，对照组在做人工流产前）。取15 mL管离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液4 mL，将4 mL外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2 000 r/min 20℃离心20 min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用。

1.2.3 流式细胞技术检查Treg百分比将PBMC调整至1×107/mL。取100 μL细胞悬液，向其中加入CD4⁃FITC，CD25⁃APC各10 μL，混匀，室温避光孵育30 min，经PBS洗涤离心后分别加入1 mL Fixation/Permeabilization破膜剂，室温避光孵育40 min，用破膜缓冲液洗涤2次后，加入10 μL Foxp3⁃PE（同型对照管加入10 μL 小鼠IgG r1⁃PE），避光孵育30 min，经破膜缓冲液洗涤2次，用500 μL PBS重悬，上流式机检测。先以FSC⁃SSC设门淋巴细胞群（gate P1），再以CD4+T细胞设门（gate P2），分析CD4+T细胞中CD25+Foxp3+Treg细胞的百分比。

1.2.4 qRT⁃PCRFoxp3 和β⁃actin引物由广州吉赛生物技术有限公司设计合成，序列如下：Foxp3⁃forward：5′⁃CATCCGCCACAACCTGAGTCTG⁃3′；Foxp3⁃reverse：5′⁃CCTGTTCGTCCATCCTCCTTT⁃CCT⁃3′；β⁃actin⁃forward：5′⁃GCACCACACCTTCTA⁃CAATGAGC⁃3′；β⁃actin⁃reverse：5′⁃GGATAGCA⁃CAGCCTGGATAGCAAC⁃3′。

取PBMC（2×106mL）按照说明书操作进行RNA提取，逆转录成cDNA，在PCR仪上按以下反应条件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60 ℃ 30 s（此步骤收集荧光信号）；45个循环，融解曲线分析：温度60～95℃。荧光实时定量PCR仪在设定相关参数后，测量出不同基因的cycle threshold（Ct值）。计算出ΔCt值及ΔΔCt。内参β⁃actin及Foxp3扩增曲线及溶解曲线如图1。

1.3 统计学方法统计数据用Graph pad Prism v5.0 software软件进行分析及作图。计量资料结果以均数±标准差表示，两组差异性比较采用t检验，相关性分析采用pearson相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象临床基本情况比较URSA稽留流产组流产次数为3～5次；正常早孕组足月分娩次数均为1～2次；研究对象年龄、月经周期，怀孕者孕周、BMI差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

2.2 Treg/CD4+T百分比在URSA患者及正常对照中的表达流式细胞技术检测Treg占外周CD4＋T细胞的百分比，结果显示见图2。正常早孕者Treg/CD4+T百分比较正常未孕者明显增高［（7.38±1.48vs.（5.67± 0.94），P＜0.000 1］；URSA稽留流产者Treg/CD4+T百分比较URSA未孕者增高［（5.72± 1.00）vs.（5.26±1.08），P=0.03］；URSA稽留流产患者Treg/CD4+T百分比较正常早孕者明显下降［（5.72±1.00）vs.（7.38±1.48），P＜0.000 1］；而URSA未孕组与正常未孕组相比Treg/CD4+T百分比差异无统计学意义［（5.26±1.08）vs.（5.68±0.94），P=0.1］

图1 内参β⁃actin及Foxp3扩增曲线及溶解曲线Fig.1 Amplification and dissolution curves of internal reference beta⁃actin and Foxp3

表1 研究对象临床基本情况比较Tab.1 Comparison of the basic clinical situation of the subjects ±s

表1 研究对象临床基本情况比较Tab.1 Comparison of the basic clinical situation of the subjects ±s

流产次数（次）足月分娩次数（次）年龄（岁）月经周期（d）孕周（d）BMI（kg/m2）URSA未孕（n=50）3～4 0 28.08±2.78 29.67±2.34-20.78±1.58正常未孕（n=25）0 1～2 28.45±2.15 29.27±1.78-21.38±2.12 URSA稽留流产（n=50）3～5 0 28.35±1.87 30.58±2.45 44.14±5.83 20.14±2.53正常早孕（n=25）0 1～2 27.35±3.17 28.58±2.17 46.48±4.66 21.53±1.43

2.3 Foxp3 mRNA在URSA患者及正常对照中的表达以qRT⁃PCR测外周血PBMC中Foxp3 mRNA水平。结果见图3。正常早孕者Foxp3 mRNA水平较正常未孕者明显增高［（3.43±0.46）vs.（3.02±0.47），P=0.003］；URSA稽留流产者Foxp3 mRNA水平URSA未孕者增高［（3.06±0.57）vs.（2.79±0.52），P=0.01］；URSA稽留流产患者Foxp3 mRNA水平较正常早孕者明显下降［（3.06±0.57）vs.（3.43±0.46），P=0.006］；而URSA未孕组与正常未孕组相比Foxp3 mRNA水平差异无统计学意义［（2.79±0.52）vs.（3.02±0.47），P=0.07］。

2.4 TGF⁃β及IL⁃10在URSA患者及正常对照中的表达以URSA稽留流产及正常早孕两组为研究对象，以ELISA方法检测两组血清中Treg相关细胞因子TGF⁃β及IL⁃10的水平，结果见图3。URSA稽留流产患者TGF⁃β及IL⁃10水平均较正常早孕者下降［TGF⁃β：（56.12± 11.25）vs.（50.12±9.78）ng/mL，P=0.02；IL ⁃10：（6.43±2.48）vs.（4.48± 2.12）pg/mL，P＜0.001］，差异有统计学意义。

3 讨论

1995年，SAKAGUCHI等［5］首次报道了在自身免疫耐受中存在一类表达IL2受体a链（IL2Ra，CD25）的T细胞亚群，并将这类CD4+CD25+T细胞命名为调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）。随后研究发现，Treg是一种具有免疫调节功能的细胞群，它能分泌IL⁃10、TGF⁃β，表达Foxp3及CTLA⁃4分子等，通过细胞间直接接触或细胞因子间接方式抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受中发挥重要作用。近年来国内外研究均证明Treg细胞在母胎免疫耐受中起着极其重要的作用［6］。

图2 Treg/CD4+T百分比在URSA患者及正常对照中的表达Fig.2 Expression of Treg/CD4+T in URSA patients and normal controls

ZENCLUSSEN［7］首先证实正常妊娠小鼠胸腺中CD4+CD25+Treg细胞较非妊娠小鼠增高，有流产倾向的小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞明显降低，而向流产倾向小鼠转入正常孕小鼠CD4+CD25+Treg细胞则可以阻止自然流产的发生。研究还发现，有流产倾向的小鼠蜕膜组织中Foxp3表达降低。国内有研究发现URSA患者CD4+CD25+Treg细胞数量较正常对照组明显下降［8］。上述研究均显示，Treg细胞与妊娠失败密切相关。本研究以CD4、CD25及Foxp3作为标记，利用流式细胞技术检测Treg占外周CD4+T细胞的百分比，数据显示：正常早孕者Treg/CD4+T百分比较正常未孕者明显增高［（7.38±1.48）vs.（5.67±0.94），P＜0.000 1］；UR⁃SA稽留流产者Treg/CD4+T百分比较URSA未孕者增高［（5.72±1.00）vs.（5.26±1.08），P=0.03］；结果显示，妊娠期母体外周Treg会显著的升高，提示Treg细胞在维持妊娠中有重要作用。数据还显示，URSA稽留流产患者Treg/CD4+T百分比较正常早孕者明显下降［（5.72±1.00）vs.（7.38±1.48），P＜0.000 1］，结果提示，外周Treg细胞数量降低可能与URSA的发生密切相关。接下来笔者利用qRT⁃PCR技术检测了Treg细胞特异性转录因子Foxp 3mRNA水平，在mRNA水平上证实了上述结果。

图3 Foxp3 mRNA在URSA患者及正常对照中的表达Fig.3 Expression of Foxp3 mRNA in URSA patients and normal controls

图4 TGF⁃β及IL⁃10在URSA患者及正常对照中的表达Fig.4 Expression of TGF⁃and IL⁃10 in URSA patients and normal controls

IL⁃10和TGF⁃β是两种参与免疫调节及具有免疫抑制功能的细胞因子，而Treg细胞可通过释放IL⁃10和TGF⁃β等抑制性细胞因子参与维持对机体免疫平衡［9-10］。研究表明，IL⁃10与TGF⁃β在母-胎免疫耐受中也起着非常重要作用。IL⁃10可以诱导滋养细胞及母胎界面单核细胞HLA⁃G基因和蛋白表达。IL⁃10还可以使单核细胞表面MHC⁃1型及Ⅱ型抗原表达降低。此外，IL⁃10还可以抑制Th1型细胞分泌Th1型细胞因子。有研究表明，IL⁃10水平降低可能与复发性流产发病有关［11］。TGF⁃β具有较强的免疫抑制功能，它可以通过下调黏附分子从而抑制内皮细胞上白细胞的附着，在移植物免疫耐受中起着非常重要的作用。此外，它还可以通过抑制T细胞增生，降低NK细胞毒性及效应性T细胞的活性，从而保护胚胎发育。有报道，妊娠期外周血单个核细胞表达TGF⁃β上调，参与维持正常妊娠，其表达下降与URSA发病有关［3］。本研究结果显示：URSA稽留流产患者TGF⁃β及IL⁃10水平均较正常早孕者下降［TGF⁃β：（56.12±11.25）vs.（50.12±9.78）ng/mL，P=0.02；IL⁃10：（6.43±2.48）vs.（4.48±2.12），P＜0.001］，说明Treg细胞的数量减少，TGF⁃β及IL⁃10表达降低，与URSA的发生有密切关系。

综上所述，Treg在维持妊娠中有重要作用；外周血Treg细胞数量及mRNA表达明显降低，TGF⁃β及IL⁃10表达降低可能与URSA的发生有密切关系。