李显永 官润云 柯坤彬 顾鹏 李同海 崔庆鹏 陈印 赵晖

昆明医科大学第一附属医院泌尿外科（昆明 650032）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）占据全球男性恶性肿瘤发病率第二位［1］。据估计，2018年全美将新增164 690例PCa，占男性新发肿瘤的19%［2］。我国PCa已是70岁以上人群致死率最高的泌尿系肿瘤，且其致死率正逐年上升，严重影响男性健康［3］。因此，对PCa发生、发展及诊治策略的深入研究迫在眉睫。近年研究发现表观遗传学在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色。N6⁃甲基腺苷（m6A）是指发生在腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰。它是真核生物mRNA中一种高丰度表观转录组学修饰，据报道，人类有近7 600种mRNA以及超过300个非编码RNA存在m6A修饰［4］。最新研究揭示m6A是一种动态可逆的RNA甲基化修饰，由甲基转移酶复合体（METTL3、WTAP、MET⁃TL14），去甲基酶（FTO、ALKBH5），相应的阅读蛋白（YTHDF、YTHDC）等协同调控［5］。METTL3作为催化RNA m6A修饰形成的甲基转移酶复合体成员之一，目前已被证实在肺癌、肝癌和白血病等肿瘤疾病中呈高表达，并发现METTL3促进了肿瘤相关癌基因的翻译，影响肿瘤的发生和进展［6-8］。而MET⁃TL3在PCa中的表达水平及其作用尚不清楚。本实验拟通过TCGA数据集资料分析并运用Westren blot、IHC技术，从mRNA和蛋白水平来研究METTL3在PCa中的表达情况，并探索其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料本实验调取2014年4月至2018年1月昆明医科大学第一附属医院病理科PCa蜡块32例和癌旁良性组织蜡块29例，制作为厚度4 μm的连续切片，用于IHC检测。其中年龄59～81岁，平均（66.09±5.49）岁；据2010年AJCC前列腺癌TNM分期标准，T1～T2期21例，T3～T4期11例；N0期27例，N1期5例；Gleason评分 ≤ 7分22例，＞7分10例。收集2018年2-4月昆明医科大学第一附属医院行腹腔镜下前列腺癌根治术切除的5例新鲜PCa和配对癌旁良性组织标本，依次编号为T1～T5，N1～N5，标本离体后迅速置入-80℃冰箱保存，用于Westren blot检测。实验前所有标本均由我院病理科HE染色证实为癌或癌旁良性组织；患者术前无长期内分泌治疗及放化疗史；并排除合并其他恶性肿瘤、免疫疾病、代谢疾病以及临床资料不全者。于 TCGA 数据集（https：//portal.gdc.cancer.gov/proj⁃ects）下载PCa的mRNA数据和匹配的临床资料，从中纳入各项资料齐全的417例PCa以及52例配对癌旁的数据。本实验经医院伦理委员会审核批准。

1.2 实验材料本实验主要材料包括：DAB免疫组织化学显色试剂盒（BBI）；兔抗人METTL3单克隆抗体（Abcam，英国）；HRP标记的兔二抗（BBI）；PBS（BBI）；兔抗beta⁃action多克隆抗体（Abcam，英国）；Tween⁃20（BBI）；蛋白提取试剂盒（上海生工）；BCA试剂盒（上海生工）；PVDF膜（广州誉维生物）；发光试剂盒（上海生工）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化学方法所有切片依次行二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；柠檬酸三钠抗原修复液，高压锅保压4 min，冷却至室温，后PBS洗3次，各3 min；3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15 min，后PBS洗3次，各3 min；6%正常山羊血清，室温封闭30 min；加兔抗人METTL3单克隆抗体（稀释浓度1∶500），4°C湿盒中孵育过夜，后PBS洗3次，各3 min；加HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育45 min，PBS洗4次，每次3 min；DAB显色，显微镜下观察控制染色时间，蒸馏水终止显色；苏木素复染5 min，1%的盐酸酒精分化，PBST洗返蓝；常规脱水、透明、封片；显微镜采图。使用PBS代替一抗作阴性对照，按抗体说明书选用人膀胱癌组织作阳性对照。

1.3.2 免疫组化结果分析METTL3蛋白以细胞中出现棕黄色染色为阳性表达。所有切片在同一条件下随机选取3个视野采图。图片使用image⁃pro⁃plus 6.0专业图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）作免疫组化结果半定量分析［9-10］，图片选择腺体区域（排除间质和腺腔部分）测积分光密度（IOD）及面积（area），以平均光密度值（IOD/area，AOD）表示单位面积阳性程度，3个视野的平均AOD值代表METTL3蛋白的表达水平。

1.4 Western blot检测取大约30 mg组织，加200 μL RIPA裂解液，低温高速匀浆10 s，共3次，冰上裂解2 h，高速离心，吸取上清。二奎琳甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，最终将浓度调整为5 μg/μL，加入5×的上样缓冲液，沸水浴10 min变性。配制12%的分离胶，5%的浓缩胶。电泳后转至PVDF膜，用5%的BSA⁃TBST封闭。分别与抗METTL3抗体（1∶1 000）和抗 β⁃action（1∶1 000）抗体温室孵育15 min，4℃过夜。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5 000），室温 40 min。TBST洗膜5次，各3 min。加入增强型化学发光剂显影3～5 min。曝光，定影，拍照。

1.5 统计学方法使用SPSS 20.0统计软件作数据分析，结果数据以均数±标准差表示。实验数据行正态性检验，组间比较采用配对或独立样本t检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 METTL3 mRNA在PCa和癌旁表达的差异TCGA数据集中52例PCa的METTL3 mRNA表达明显高于配对癌旁组织［（7.718±2.151）vs.（5.700± 1.385）］，差异具有统计学意义（t=7.257，P＜0.01），见图1。

图1 52例PCa和配对癌旁组织METTL3 mRNA表达情况Fig.1 Expression of METTL3 mRNA in 52 cases of prostate cancer and adjacent tissues

2.2 METTL3蛋白在PCa和癌旁表达的差异IHC结果表明PCa和癌旁组织中METTL3蛋白的表达主要定位于细胞核，细胞质中少量表达。METTL3蛋白在PCa组织中表达水平明显高于癌旁良性组织［0.074± 0.055）vs.（0.026±0.018）］，其差异有统计学意义（t=4.655，P＜ 0.01），见图2。Western blot结果显示METTL3蛋白在PCa中表达 量明显高于配对癌旁良性组织，见图3。

图2 METTL3蛋白在不同组织中的表达情况Fig.2 Expression of METTL3 protein in different tissues

图3 5例PCa和配对癌旁组织METTL3蛋白的表达情况Fig.3 Expression of METTL3 protein in 5 cases of prostate cancer and adjacent tissues

2.3 METTL3 mRNA和蛋白在PCa中表达水平与临床病理特征的相关性Spearman等级相关分析发现，METTL3 mRNA表达水平与PCa的Gleason评分呈正相关（r=0.195，P＜0.01），而与年龄、T分期和N分期无相关性（P＞0.05），见表1；METTL3蛋白表达水平跟PCa的PSA值、Gleason评分呈正相关（r=0.381，P＜0.05；r=0.449P＜0.01），而与年龄、T分期、N分期无相关性（P＞0.05），见表2。

3 讨论

METTL3最早是从Hela细胞裂解液中鉴定出的一个70 kDa的蛋白［11］，后续的研究发现其包含结合S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和催化m6A形成的两个结构域，具有独立催化RNA的m6A修饰形成的活性［12］。近期研究表明METTL3还可以与MET⁃TL4结合形成异质二聚体［13］，WTAP促进其在核斑点的定位，使其催化活性大大提升［14］。m6A是目前发现的100多种RNA转录后修饰中丰度最高的修饰方式［15-16］。m6A修饰在RNA中的定位主要存在Rm6ACH（R=G或A，H=A、C或U）这一共有序列［13］，运用高通量测序技术发现m6A峰分布在mRNA 的 3′非翻译区（3′UTR）、5′非编码区（5′UTR），内部外显子、翻译起始和终止密码子附近区域［17-18］，鉴于其分布，进一步研究发现m6A可能对mRNA的剪切、3′端的加工、mRNA的出核，翻译效率、mRNA的衰退以及对miRNA的加工发挥重要作用，从而影响多种生物学功能，包括：DNA损伤修复、昼夜节律、组织发育、性别的决定和肿瘤的发生［5，19］。

表1 TCGA PCa数据集METTL3 mRNA的表达与PCa临床病理特征的相关性分析Tab.1 The relationship between the expression of METTL3 mRNA and clinical characteristics of prostate cancer in TCGA PCa dataset±s

表1 TCGA PCa数据集METTL3 mRNA的表达与PCa临床病理特征的相关性分析Tab.1 The relationship between the expression of METTL3 mRNA and clinical characteristics of prostate cancer in TCGA PCa dataset±s

注：**在置信度（双侧）为0.01时，相关性是显著的

P值例数METTL3 mRNA表达水平r值294 123特征年龄≤65岁＞65岁Gleason评分≤7≥8 T分期T1～T2 T3～T4 N分期8.486±2.608 8.596±2.269 0.0220.650 228 189 8.056±2.627 9.076±2.244 0.1950.000**143 274 8.331±2.416 8.616±2.557 0.0490.314 0.0570.242 N0 N1 339 78 8.450±2.514 8.815±2.489

表2 METTL3蛋白的表达与PCa临床病理特征的相关性分析Tab.2 The relationship between the expression of METTL3 protein and clinical characteristics in prostate cancer±s

表2 METTL3蛋白的表达与PCa临床病理特征的相关性分析Tab.2 The relationship between the expression of METTL3 protein and clinical characteristics in prostate cancer±s

注：*在置信度（双侧）为0.05时，相关性是显著的；**在置信度（双侧）为0.01时，相关性是显著的。PSA：前列腺特异性抗原。Gleason评分：PCa病理分级使用的评分系统

特征年龄≤65岁＞65岁Gleason评分≤7≥8 PSA≤20 ng/mL＞20 ng/mL T分期T1～T2 T3～T4 N分期例数METTL3蛋白表达水平AOD值r值P值18 14 0.080±0.045 0.065±0.066-0.1660.363 22 10 0.061±0.043 0.102±0.068 0.3810.031*21 11 0.064±0.048 0.091±0.064 0.4490.010**21 11 0.063±0.051 0.094±0.058 0.2290.096 N0 N1 27 5 0.079±0.057 0.043±0.023-0.2280.209

METTL3在恶性肿瘤中扮演重要角色。本实验发现PCa组织中METTL3的mRNA和蛋白水平均明显高于癌旁良性组织，且METTL3蛋白在前列腺细胞核和细胞质中均有表达。LIN等［17］在肺癌的研究中也发现METTL3表达上调，并在人肺癌细胞的细胞核和胞质裂解液中分别检测到METTL3蛋白的表达，而其他甲基催化酶则只在细胞核中检测到表达，这与本实验结果相符。该研究还运用meRIP⁃Seq技术发现人肺癌细胞系中癌基因EGFR、TAZ、MAPKAPK2（MK2）和DNMT3A的终止密码子附近存在一个或多个m6A峰；敲低METTL3后，相关癌基因mRNA的m6A修饰水平下降，其蛋白水平也明显下降；进一步研究还发现METTL3也可以独立于其他m6A修饰酶招募翻译起始因子eIF3来促进目的基因的翻译。在白血病的研究中也表明，METTL3呈高表达，并促进了c⁃MYC、BCL2和PTEN癌基因的翻译，维持急性髓系白血病的增殖［8］。CAI等［20］在乳腺癌中发现上调 METTL3 可使肿瘤相关蛋白HBXIP的mRNA m6A修饰丰度增加，从而使其蛋白表达增加，促进乳腺癌细胞的增殖和生长，沉默METTL3后有效地抑制乳腺癌细胞的增殖和促进凋亡。然而，在宫颈癌和肾癌中METTL3呈低表达，上调其表达可有效抑制肿瘤进展，表现出肿瘤抑制因子的角色［21-22］。由此可见METTL3在不同肿瘤中发挥着促癌或者抑癌的双重作用，笔者推测METTL3在PCa中发挥促癌的作用，高表达的METTL3可能促进了PCa某些癌基因的翻译，从而影响PCa的发生和发展。

METTL3催化mRNA的m6A修饰形成，影响着多种生物进程。本实验发现，PCa中METTL3 mRNA和蛋白的水平与Gleason评分呈正相关，即METTL3 mRNA和蛋白的表达水平与PCa细胞分化呈负相关关系。VU等［23］在急性髓系白血病中得出相似的结论，高表达的METTL3抑制了骨髓造血干细胞的分化，敲低METTL3后急性髓系白血病细胞周期停滞，有效地促进造血干细胞的分化。METTL3催化的mRNA m6A修饰还可以调节精原细胞的分化，促进精子成熟［24］。LI等［25］研究还发现m6A修饰影响了T细胞在体内的平衡和分化，这也暗示m6A修饰可能参与了肿瘤的免疫调节。此外，在胰腺癌的治疗研究中发现，敲低METTL3后，癌细胞对化疗药物：吉西他滨、5-氟尿嘧啶、顺铂和放疗具有更高的敏感性［26］，这也提示METTL3可能是肿瘤治疗的一个新靶点。

PCa的诊疗中，PSA被作为一项有效的临床筛查和风险评估的指标。本实验发现METTL3蛋白的表达水平与PSA值呈正相关关系，结合METTL3与多种肿瘤的相关性，提示METTL3具有与PSA联合作为PCa诊断标记物的潜能。

综上所述，本研究通过对TCGA数据集资料分析并运用Western blot、IHC技术，从mRNA、蛋白水平证明METTL3在PCa中呈高表达，其蛋白表达主要定位在前列腺细胞核，胞质少量表达，METTL3表达水平与Gleason评分和PSA值呈正相关。因而我们推测高表达的METTL3可能调控某些癌基因的翻译，促进PCa的发生、发展，影响PCa细胞的分化，同时可能与PSA联合作为PCa的诊断标记物。本课题组后续将扩大样本量研究，继续探讨METTL3在PCa中的表达及临床意义，并结合分子生物学实验、细胞实验进一步阐述其在PCa可能的机制以及与其他m6A修饰酶的相互关系。