李莹 刘琦 欧三桃 吴蔚桦 甘林望

西南医科大学附属医院肾内科（四川泸州 646000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）作为终末期肾病，是糖尿病患者的主要死亡原因之一［1-3］。研究发现，长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，Lnc RNA）异常表达在DN等多种疾病中扮演着重要角色［4-5］。然而，LncRNA在DN的炎症过程中的功能和作用机制仍未揭开神秘面纱。

LncRNA作为一类长度超过200个核苷酸的功能性RNA，LncRNA可在多水平调控基因表达，与miRNA、mRNA或蛋白质结合发挥转录后水平的调控等［6-7］。研究表明，LncRNA的表达与许多内分泌和代谢疾病密切相关［8-9］，而在DN方面的研究还处于起步阶段。课题组前期通过基因芯片发现LncRNA KCNQ1重叠转录物1（KCNQ1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1）在DN患者血清中明显高于正常对照组，本研究拟进一步探讨LncRNA KC⁃NQ1OT1在DN中的作用及意义，通过本研究为阐明DN的发病机制提供新的理论基础，为DN的治疗和预后分析提供新的生物学标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2015年1月至2017年12月于我院就诊的137例糖尿病患者，77例Ⅱ型糖尿病（T2D）患者（无DN病史，无蛋白尿）中，60例T2D合并DN（30例微量白蛋白尿，30例大量蛋白尿），同时收集于我院体检中心就诊的60例非糖尿病健康者作为对照组，收集所有研究对象的外周血液标本同时收集样本临床资料，研究对象一般资料见表1。研究对象中包括77例T2D患者（无DN病史，无蛋白尿）作为T2D组，60例T2D合并DN（30例微量白蛋白尿，30例大量蛋白尿）作为DN组，60例非糖尿病健康者作为对照组，3组患者的年龄、性别、平均血压、糖尿病病程、体质指数（BMI）之间差异无统计学意义（P＞0.05），甘油三酯在DN组较T2D组及对照组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而T2D组及对照组间甘油三酯的量差异无明显差异（P＞0.05）；DN组患者的蛋白尿及血清肌酐较T2D组及对照组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。DN组患者的肾小球滤过率（eGFR）明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而T2D组及DN组两组患者的糖化血红蛋白较对照组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在通过本院伦理委员会批准，研究对象知情同意的同时采集静脉血液标本5 mL，将收集的血液标本静置于4℃冷藏30 min后，室温下3 000 r/min离心15 min，留取上层血清，置于-80℃冰箱备用。

1.2 Real⁃time PCR分析LncRNA KCNQ1OT1的表达水平应用TRIzol（美国Invitrogen公司产品）试剂提取血清中总RNA。将提取的总RNA，参照AMV逆转录试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司产品］说明书提供的方法将其反转录成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix［宝生物工程（大连）有限公司产品］，以cDNA为摸板，进行qRT⁃PCR。根据目标基因设计合成相应上下游引物进行PCR扩增，以P53作为内参照。KCNQ1OT1上游引物5′⁃CCCAGAAATCCACACCTCGG⁃3′；下游引物 5′⁃TCCTCAGTGAGCAGATGGAGA⁃3′；P53 上游引物5′⁃TACATGGGCCGAGGCAAGATAA⁃3′；下游引物5′⁃ATAGCCCAGGGAAGTGAAGGTGTC⁃3′。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；（95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s）×40 个循环。以 2⁃ΔΔCt值表示 LncRNA KC⁃NQ1OT1的表达水平。

表1 研究者的一般临床资料Tab.1 Baseline characteristics of subjects ±s

表1 研究者的一般临床资料Tab.1 Baseline characteristics of subjects ±s

临床特征性别（男/女）年龄（岁）平均血压（mmHg）甘油三酯（mmol/L）空腹血糖（mmol/L）糖尿病病程（年）BMI（kg/m2）蛋白尿（mg/24 h）血清肌酐（mmol/L）eGFR［mL/（min·1.73 m2）］糖化血红蛋白（%）T2D（n=77）39/38 60.2±10.0 86.0±12.0 1.5±0.7 8.5±1.7 15.5±5.0 25.7±4.8 6.7±3.4 65.7±9.0 95.7±9.0 8.7±3.0 DN（n=60）29/31 64.0±7.4 96.2±10.0 2.8±0.4 8.9±1.3 18.0±6.7 26.9±5.5 1236.7±49.0 120.8±35.0 65.0±12.0 9.4±2.2 Control（n=60）28/32 62.8±6.1 84.2±5.0 1.2±0.5 4.5±0.9 24.9±3.6 3.8±1.8 50.8±11.4 105.0±13.0 4.1±0.6 P值0.920 0.690 0.173 0.020 0.007 0.792 0.690＜0.001 0.001 0.019 0.030

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用t检验或One⁃way ANOVA分析，用表示；LncRNA KCNQ1OT1与各临床病理参数之间的关系使用Chi⁃Square检验；ROC分析评估LncRNA KCNQ1OT1作为DN的生物标志物潜能的分析；Pearson′s线性回归法分析KC⁃NQ1OT1与蛋白尿、肾小球滤过率及其他临床病理特征的相关性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA KCNQ1OT1在T2D、DN患者及健康对照组中的表达QRT⁃PCR检测LncRNA KC⁃NQ1OT1在T2D组、DN组及健康对照组患者中的差异表达，结果提示与健康对照组比较，LncRNA KCNQ1OT1在T2D、DN患者中的表达明显升高，差异具有统计学意义（F=19.790，P＜ 0.001，图1）；进一步分析发现，DN组患者LncRNA KCNQ1OT1的表达较T2D患者明显升高，差异具有统计学意义（t=25.570，P＜ 0.001，图1）。

2.2 LncRNA KCNQ1OT1在不同量蛋白尿中的表达进一步检测不同程度蛋白尿患者LncRNA KCNQ1OT1的表达，结果提示LncRNA KCNQ1OT1在DN合并大量蛋白尿患者血清中的表达较DN合并微量蛋白尿患者及T2D患者（正常尿蛋白）明显升高，差异具有统计学意义（F=17.630，P＜0.001，图2）。在DN患者中，合并大量蛋白尿患者的LncRNA KCNQ1OT1表达较合并微量蛋白尿患者明显升高，差异具有统计学意义（t=13.620，P＜0.001，图2）。

图2 LncRNA KCNQ1OT1在不同量蛋白尿中的表达Fig.2 Association of LncRNA KCNQ1OT1 levels with the degree of albuminuria

2.3 LncRNA KCNQ1OT1的表达与析糖尿病肾病患者的蛋白尿及肾小球滤过率的相关性Pearson′s线性相关系数分析血清LncRNA KCNQ1OT1的表达与DN患者的蛋白尿中及肾小球滤过率的相关性，结果提示血清LncRNA KCNQ1OT1的表达与蛋白尿的表达量呈正相关关系（r=0.690，P＜0.001，图3A）；而与肾小球滤过率呈负相关关系（r=-0.780，P＜ 0.001，图3B）。

图3 Pearson′s线性相关系数分析血清LncRNA KCNQ1OT1的表达与糖尿病肾病患者的蛋白尿中及肾小球滤过率的相关性Fig.3 Pearson′s coefficient correlation analysis was undertaken in patients with DN to determine the correlation between circulating LncRNA KCNQ1OT1 levels and albuminuria，eGFR

2.4 受试者工作特征曲线（ROC）分析首先采用ROC分析在DN患者和T2D患者间LncRNA KCNQ1OT1作为DN患者血清标志物的潜能。结果发现，ROC曲线下面积（AUC）为 0.861（95%CI：0.786～0.935，P＜0.001，图4A）；进一步在DN和健康对照组间分析LncRNA KCNQ1OT1作为DN患者血清标志物的潜能，结果发现AUC为0.914（95%CI：0.828 ～ 0.980，P＜ 0.001，图4B）。

3 讨论

KCNQ1OT1，是一个位于KCNQ1位点的长链非编码RNA基因［10］。KCNQ1OT1是一个印迹基因，只表达父源等位基因［11-12］。近年来的研究发现，印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病，印记基因的异常与恶性肿瘤的发生相关［13］，也与炎症及血管疾病相关［14］。

图4 受试者工作特征曲线（ROC）分析LncRNA KCNQ1OT1作为判别DN患者血清标志物的潜能Fig.4 The receiver operating characteristic（ROC）analysis was used to assess the biomarker potential of LncRNA KCNQ1OT1

本研究结果提示KCNQ1OT1在T2D及DN患者中的表达较健康对照组明显升高。KCNQ1OT1在合并大量蛋白尿的DN患者中的表达明显高于合并微量蛋白尿患者。KCNQ1OT1的表达与蛋白尿的水平呈正相关关系，与肾小球滤过率呈负相关关系。在T2D与DN患者中KCNQ1OT1作为DN患者血清标志物的潜能的AUC为0.861，在DN患者与健康患者中KCNQ1OT1作为DN的AUC为0.914。以上研究结果提示KCNQ1OT1的高表达与T2D患者DN的发展有关，有望成为预测DN患者预后的生物标志物。本研究首次报道了KC⁃NQ1OT1在DN患者血清中高表达，其表达与DN患者蛋白尿的量及肾小球滤过率相关，本研究将进一步丰富DN的发病机制，为DN靶基因治疗提供新的靶点，为寻找DN诊断及预后的生物学标志物的研究提供依据，为解决临床棘手的DN提供一种新策略。但影响DN的因素很多，其具体的发病机制及诊断及预后疗效评估尚需进一步深入研究。