黄超有 李玺 韩铮 朱珊珊

1广州市番禺区何贤纪念医院乳腺甲状腺外科（广州 511400）；2中山大学附属第三医院乳腺甲状腺外科（广州 510630）

乳腺癌是国内女性最常见恶性肿瘤，严重威胁女性身心健康［1］，其发生、发展及转归受到多种因素调控，上皮⁃间充质转化（epithelial⁃mesenchy⁃mal transition，EMT）是其中重要因素［2］。EMT 可显著促进肿瘤局部浸润和远处转移［3］，其还与肿瘤化疗耐药和肿瘤干细胞形成密切相关［4］。研究表明Prefoldin（PFDN）亚型PFND1直接参与调控细胞骨架重排［5］，而细胞骨架重排又是EMT的重要环节［6］，但PFND1是否对乳腺癌癌细胞EMT过程产生影响未见报道。本研究拟以乳腺癌BT474细胞株为材料，PFND1对乳腺癌癌细胞EMT过程的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器乳腺癌BT474细胞株，购自中科院上海细胞生物研究所；pLKO.1慢病毒表达载体，购自美国 Sigma；PrimeScript®RT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR®Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），购自日本TaKaRa；羊抗人PFDN1多克隆抗体，购自美国Santa Cruz；鼠抗人GAPDH单克隆抗体、兔抗人E⁃cadherin抗体、兔抗人N⁃cad⁃herin抗体、兔抗人vimentin抗体，购自美国CST公司；Western一抗稀释液、Western一抗二抗去除液，购自碧云天生物；聚碳酯膜（PC）Transwell®嵌套（24孔板专用），购自美国 corning；LEGEND MI⁃CRO17离心机、LEGEND MACH 1.6R离心机，购自美国Thermo；-80℃超低温冰箱，购自日本SANYO；M5多功能酶标仪，购自美国Molecμlar Devices；7500型实时荧光定量PCR系统，购自美国ABI。

1.2 实验方案

1.2.1 细胞培养BT474细胞培养于含10%胎牛血清和1%青、链霉素的RPMI⁃1640培养基，并置于37℃5%CO2细胞培养箱。

1.2.2 慢病毒真核表达载体构建使用pLKO.1慢病毒表达载体构建pLKO.1⁃sh⁃PFND1，并设1种对照片段，包装生产相应的慢病毒，感染BT474细胞株。根据载体种类将转染实验分成3组：转染组，由含干扰片段质粒转染；空白转染组，由含对照片段质粒转染；未转染组，不进行转染操作。

1.2.3 细胞侵袭和迁移能力检测取对数生长期细胞，血清饥饿过夜，胰酶消化后以无血清RPMI⁃1640重悬为单细胞悬液，浓度为1.0×105/mL及1.0×104/mL，分别用于Transwell侵袭和迁移实验。

1.2.4 PFDN1及EMT标志分子mRNA表达情况提取总RNA，逆转录为cDNA，采用Real⁃time PCR 检测PFDN1、E⁃cadherin、N⁃cadherin、Vimentin mRNA。根据2-△△CT方法计算各待测mRNA相对于内参的相对表达量。

1.2.5 PFDN1及EMT标志分子蛋白表达情况提取总蛋白，测定蛋白浓度后，电泳、转膜，采用Western blot法检测PFDN1、E⁃cadherin、N⁃cadherin、Vimentin蛋白。以各蛋白条带灰度值/GAPDH灰度值代表各蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0处理数据，各实验均重复3次，计量资料按（）表示。多组间对比采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定低表达PFDN1的BT474细胞系验证与未转染组对比，转染组PFDN1 mRNA及蛋白表达明显下降（P＜0.05），空白转染组PFDN1 mRNA及蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。见表1。

表1 3组BT474细胞系PFDN1 mRNA及蛋白表达情况对比Tab.1 Comparison of PFDN1 mRNA and protein expression in three groups（n=3） ±s

表1 3组BT474细胞系PFDN1 mRNA及蛋白表达情况对比Tab.1 Comparison of PFDN1 mRNA and protein expression in three groups（n=3） ±s

注：与转染组对比，*P＜0.05；与空白转染组对比，#P＜0.05

组别PFDN1 mRNA PFDN1蛋白转染组空白转染组未转染组F值P值0.42±0.02 0.67±0.29*1.00±0.00*25.463 0.001 0.70±0.11 4.04±0.17*4.40±0.20*#451.233 0.000

2.2 3组细胞系侵袭及转移能力对比细胞侵袭实验中，转染组细胞穿过小室膜的细胞数为（28.33±4.16）个，空白转染组为（77.33±6.51）个，未转染组为（81.00±8.00）个，转染组上述细胞数明显低于空白转染组及未转染组（P＜0.05），见图1。细胞迁移实验中，转染组穿过小室膜的细胞数为（22.33±2.08）个，空白转染组为（34.00±2.65）个，未转染组为（37.00± 3.61）个，转染组上述细胞数明显低于空白转染组及未转染组（P＜0.05）。见图2。

图1 3组Transwell侵袭实验检测结果（×200）Fig.1 Transwell invasion test in three groups

2.3 3组细胞EMT标志分子mRNA表达转染组E⁃cadherin mRNA表达水平明显高于空白转染组和未转染组，N⁃cadherin mRNA和Vimentin mRNA表达水平明显低于未转染组（P＜0.05）。见表2。

2.4 3组细胞EMT标志分子蛋白表达转染组E⁃cadherin蛋白水平明显高于其他两组，N⁃cad⁃herin、Vimentin蛋白水平明显低于其他两组（P＜0.05）。见图3、表3。

图2 3组Transwell迁移实验检测结果（×200）Fig.2 Transwell migration test in three groups

表2 3组细胞EMT标志分子mRNA表达情况对比Tab.2 Comparison of expression of EMT marker mRNA in three groups（n=3） ±s

表2 3组细胞EMT标志分子mRNA表达情况对比Tab.2 Comparison of expression of EMT marker mRNA in three groups（n=3） ±s

注：与转染组对比，*P＜0.05

组别转染组空白转染组未转染组F值P值E⁃cadherin mRNA 5.33±2.31 1.33±0.58*1.00±0.00*9.235 0.015 N⁃cadherin mRNA 0.25±0.00 0.75±0.43 1.00±0.00*7.000 0.027 Vimentin mRNA 0.42±0.14 0.67±0.29 1.00±0.00*7.400 0.024

表3 3组细胞EMT标志分子蛋白表达Tab.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups（n=3） ±s

表3 3组细胞EMT标志分子蛋白表达Tab.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups（n=3） ±s

注：与转染组对比，*P＜0.05

组别转染组空白转染组未转染组F值P值E⁃cadherin 蛋白1.25±0.08 0.58±0.07*0.54±0.06*96.101 0.000 N⁃cadherin 蛋白0.61±0.07 0.94±0.06*1.07±0.10*27.357 0.001 Vimentin蛋白0.47±0.08 0.91±0.14*1.13±0.17*18.514 0.003

图3 3组细胞EMT标志分子蛋白表达情况对比Fig.3 Comparison of expression of EMT marker proteins in three groups

3 讨论

肿瘤侵袭与转移是导致乳腺癌治疗失败和转移复发的重要原因，一旦发生转移，乳腺癌患者生存率明显下降［7］。如何降低乳腺癌早期复发及远处转移风险，是我们的研究的重要课题。

EMT是影响肿瘤侵袭转移能力的重要因素，在乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤侵袭转移过程中，均能够发现EMT现象［8-9］。EMT过程中，细胞发生形态学变化，极性消失，细胞骨架重排，细胞侵袭和迁移能力增加［10］，此过程常伴随一系列标志分子的变化，包括上皮表型标志分子E⁃cadherin下降，间质表型标志分子N⁃cadherin、Vimentin等上升［11］。本研究构造稳定低表达PFDN1的转染组，显示转染组E⁃cadherin表达水平明显高于空白转染组及未转染组，而N⁃cadherin、Vimentin表达水平明显低于空白转染组及为转染组，提示PFDN1可能与乳腺癌EMT有关。经Transwell细胞侵袭及迁移实验，也能够证实抑制PFND1表达，乳腺癌细胞侵袭和迁移能力明显下降。

PFDN是一组辅助伴侣蛋白，既往多项报道证实该组蛋白与肿瘤进展有关：FAROOQ等［12］指出其在HepG2肝癌细胞株中，与组蛋白去乙酰化酶1有高亲和力，而后者有诱导肝癌细胞凋亡的作用；PFDN4在结直肠癌组织中低表达，且与肿瘤细胞侵袭能力有关［13］；RIESTER等［14］报道显示尿路上皮癌患者PFDN2高表达多预示着较差的预后；本研究前期也观察到乳腺癌组织中PFDN1表达明显强于正常乳腺组织。针对肿瘤细胞EMT的报道还显示，PFDN1与肺癌细胞［7］、结直肠癌［15］细胞EMT过程有关，本研究则提示PFDN1还与乳腺癌EMT过程有关。上述既往报道推测PFDN1主要通过影响细胞骨架重组，进而影响EMT过程。PFDN1的主要功能是捕获未折叠多肽，协助其折叠并将其传送至CCT，除底物传送功能外，其还可以提高肌动蛋白和微管蛋白折叠的效率，这是因为PFDN1还能够将部分折叠的底物分子返回至CCT，以实现下一循环的折叠，故缺乏PFND1可能导致肌动蛋白和微管蛋白折叠效率下降。而微管是细胞骨架的主要成分之一，这说明PFND1对细胞骨架重组效率有一定促进作用，细胞骨架重组又是EMT的关键过程，因此PFND1可能通过影响细胞骨架重组，进而影响乳腺癌EMT过程。

综上，PFDN1能够促进乳腺癌BT474细胞EMT转化，抑制PFDN1表达可能有助于抑制乳腺癌EMT过程。但本研究仅为体外研究，可能并不足以证实PFDN1对乳腺癌癌细胞EMT的影响，仍需后续研究补充。