张桂清, 杨宇森, 许艺敏, 罗海凌, 姚俊新, 林占熺

(福建农林大学国家菌草工程技术研究中心,福建 福州 350002)

紫苏(PerillafrutescensL.)系唇形科紫苏属一年生草本植物,是我国传统的药食两用植物[1],是国家卫生部首批颁布的既是“食品又是药品”的物品之一.其主要含有紫苏醛、紫苏醇、丁香油酚以及紫苏苷、木犀草素、芹菜苷、芹黄素等多种黄酮类化合物[2,3].由于存在结构的差异, 黄酮类化合物表现出不同的生物活性.有的黄酮可促使血管扩张,增加冠状动脉血流量,从而起到降血压、降血脂、增大心脏血流量、降低心率等作用[4]；某些黄酮还具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞生长、保肝护肝及抗氧化等作用[5].

紫苏独具降压、助消化、解热、镇静、止咳平喘、增强免疫力、抗癌、降血脂、清热解毒等功效,其各部位都具有较好的抗癌作用,尤以叶片的作用更强,紫苏籽中所含黄酮类化合物具有显著的抗动脉硬化和降低甘油三脂的作用[6].近年来,紫苏因具有独特的活性物质及营养成分,随着对紫苏含有的多种营养成分和活性物质的深入研究,其开发利用研究也日益成为世界性的热点课题.紫苏适应性较强、对土壤要求不严,易于种植,产量高,降脂效果显著,大面积推广和应用必将提高我国人口的健康状况,对国家卫生保健事业的发展起到积极促进作用.

通过系统的化学研究,目前已从紫苏中分离鉴定出百余种化合物,包括挥发油类、萜类、黄酮类、甾醇类和酚类等.随着技术的不断发展,液相色谱—质谱联用(LC-MS)已成为解析复杂组分的常用分析方法之一.采用高效液相色谱—飞行时间质谱系统、液相色谱—四极杆飞行时间串联质谱(QTOF/MS)结合液相色谱-离子阱质谱(IT/MS)鉴定紫苏化学成分的报道较少,采用高分辨离子淌度液质联用仪(超高效液相UPLC-SYNAPT G2-Si HD质谱联用)技术鉴定其它植物鲜有报道,但采用高分辨离子淌度液质联用技术鉴定紫苏化学成分尚未见报道.四级杆质量分析器对高质量数离子有质量歧视效应、分辨率较低、适用质量范围较小；飞行时间质量分析器存在分辨率低,无串极功能,限制了进一步的定性能力；液相色谱—离子阱质谱(IT-MS)通常是低分辨质谱,无法获得准确质量信息,定量灵敏度低于四级杆分析器,而且MS/MS模式下离子阱中碎裂程度低于串联四级杆,因为母离子在离子阱中不会进一步碎裂,此外,IT-MS不能获得分子式,不适用于定量分析；液相色谱—四极杆飞行时间串联质谱(QTOF-MS)结合液相色谱—离子阱质谱(IT-MS),虽然结合了二者功能的一些优点,但总体存在分辨率较低的缺点.

采用高效的T-Wave离子淌度分离技术,增加了分离维度,具有无可比拟的离子淌度性能,可提供更详细的信息,显著提高了分析的峰容量、特异性和灵敏度,SYNAPT G2-Si拥有独特的研发优势,其巨大的潜力更可满足未来需求.本研究采用高分辨离子淌度液质联用仪,获取精确相对分子质量或裂解行为以推断可能的分子式和化学结构,实现了紫苏超声波协同微波和二次微波法提取物复杂组分的较系统的快速分析鉴定,为紫苏资源开发利用及临床应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

高分辨离子淌度液质联用仪,其中质谱仪为SYNAPT G2-Si HD(英国,沃特世)、ACQUITY(美国,沃特世)超高效液相色谱仪、超离心研磨仪(德国,RetschZM200)、电脑紫外检测仪(HD-3000,上海嘉鹏科技有限公司)、程控多功能全自动部分收集器(CBS-B,上海嘉鹏科技有限公司)、恒流泵(HL-2S,上海嘉鹏科技有限公司)、中压特制玻璃层析柱(CXZ-5 cm×20 cm)、大孔弱酸性阳离子交换树脂(D152,北京索莱宝科技有限公司)、甲酸(CFTB-94318-250ML,上海安谱实验科技股份有限公司)、乙腈(sigma)、LCMS级、NaOH(分析纯,西陇化工股份有限公司)、HCl(分析纯,西陇化工股份有限公司)、乙醇(分析纯,西陇化工股份有限公司)、紫苏(广东汇群中药饮片股份有限公司).

1.2 方法

1.2.1 粗黄酮制备 (1)超声波协同微波提取紫苏茎和叶:称取紫苏茎和叶放在烘干箱中干燥5 h,之后用德国Retsch(莱驰)ZM200超离心研磨仪(RetschZM200)研磨成约40 μm紫苏粉末.称取该粉末50 g,用1 000 mL 61%乙醇浸泡20 min,超声时间30 min,水浴温度40 ℃,过滤后低压浓缩并冷冻干燥.

(2)二次微波提取紫苏茎和叶:称取紫苏茎和叶放在烘干箱中干燥5 h,之后用德国Retsch(莱驰)ZM200超离心研磨仪(RetschZM200)研磨成大约40 μm紫苏粉末.称取该粉末,料液比1∶20(50 g紫苏粉末溶于1000 mL 61%乙醇),提取时间30 min,功率800W×60%,乙醇体积分数61%,提取2次,过滤,低压浓缩,冷冻干燥.

1.2.2 粗黄酮纯化 先预处理D152大孔树脂,之后装上Ø5cm×24 cm的玻璃层析柱.采用61%(体积分数)乙醇进行洗脱柱子，恒流泵(HL-2S)转速45 r·min-1,实际流速约1.53 mL·min-1洗脱柱子,直至阈值低于6 MV,洗脱液开始从收集器废液管流出时,收集管子,并集中在一起.过滤,浓缩,冷冻干燥.

1.3 材料处理

称取纯化黄酮粉50 mg溶于10 mL甲醇中,浓度为5 mg·mL-1,离心,转速8 000 r·min-1.

1.4 高分辨离子淌度液质联用系统条件

1.4.1 色谱分析条件 超高效液相：ACQUITY,色谱柱：HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm),色谱梯度洗脱溶剂：水(0.1%甲酸)、乙腈(0.1%甲酸)、进样量1 μL,流速0.45 mL·min-1(表1).

表1 超高效液相色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure for ultra-high performance liquid chromatography

1.4.2 质谱条件 仪器:SYNAPT G2-Si HDMS,离子模式:电喷雾离子源(ESI),负离子扫描模式,数据采集：MSe,ramp:10～50 ev,m/z扫描范围:50～1 200 Da,Lockspray校正系统:亮氨酸—脑啡肽,毛细管电压：(ESI-:3.0 kV),离子源温度:120 ℃,脱溶剂温度:450 ℃,脱溶剂气体流速:800 L·h-1,锥体气流速:50 L·h-1,样品孔电压:40 V,源偏移:80,雾化器气流:6.5,扫描时间:0.2 s.

2 结果与分析

采用高分辨离子淌度液质联用(超高效液相UPLC-SYNAPT G2-Si HD质谱联用)技术鉴定紫苏化学成分,在全波长UV谱与总离子流谱图中(图1,2),各峰得到较好分离.通过对各化合物进行Masslyznv4.1软件分析和数据库(human metabolome、reaxys、pubchem)查询,对各色谱峰准分子离子与碎片离子的高分辨质谱数据进行分析,结合文献中紫苏植物化学研究结果,初步鉴定出10种化学成分(表2),这些化合物从结构类别上看主要为酚酸与黄酮类两大类成分.

表2 高分辨离子淌度液质联用技术鉴定紫苏超声波协同微波和二次微波提取物的相同化学成分Table 2 High-resolution ion mobility liquid chromatography-mass spectrometry to identify the same chemical constituents of perilla-extracted by ultrasonic synergistic microwave and secondary microwave

2.1 迷迭香酸及咖啡酸四聚体类化合物

色谱峰保留时间为5.16 min,其准分子离子峰[M-H]-m/z 359.076 9,同时还可观察到二聚体离子峰[2M-H]-m/z 719.163 0,及其碎片离子m/z分别为[M-H-Caffeoyl]-197.045 4,[M-H-Caffeoyl-H2O]-179.036 4,[M-H-C9H10O5]-161.0240,[M-H-Caffeoyl-H2O-CO2]-135.045 2.m/z 179.036 4[Caffeicacid-H]为咖啡酸,m/z 135.045 2[Caffeicacid-H-CO2]为咖啡酸失去1个中性碎片CO2产生的离子m/z 135[M-H-CO2],这是典型的迷迭香酸的质谱特征,因此推测此化合物为迷迭香酸[7-9].而且,咖啡酰基与葡萄糖基在高能量质谱中的准确相对分子质量(162.031 7和162.052 8)存在显著差异,本研究的[M-H-C9H10O5]-161.024 0,准确相对分子质量为162.024 0,与咖啡酰基准确相对分子质量(162.031 7)较接近,可信度较高,因此,本研究[M-H-C9H10O5]-161.024 0应为咖啡酰基,而不是葡萄糖基,这进一步证明该化合物含有咖啡酰基,而迷迭香酸包含咖啡酰基,因此,推断该化合物为迷迭香酸.

色谱保留时间4.804 min,检测到质谱峰m/z 719.161 7,其低能量质谱中仅有较弱碎片离子峰m/z 359.076 4.此化合物的高能量质谱中,观察到碎片离子m/z 197.044 3,179.03 53与161.023 9,135.045 0这些碎片离子质量表明此化合物与迷迭香酸有相似的结构特征,故推测此化合物可能为咖啡酸四聚体类化合物或迷迭香酸二聚体.具有此特征的咖啡酸四聚体类化合物未见文献报道,因此有可能为新化合物,但其结构有待进一步结合磁共振技术进行结构鉴定.

2.2 黄酮类化合物鉴定

黄酮及其苷类化合物质谱特征较为明确,通过对各化合物进行Masslyznv4.1软件分析和数据库(human metabolome、reaxys、pubchem)查询,对各色谱峰准分子离子与碎片离子的高分辨质谱数据进行分析,结合文献中紫苏植物化学研究结果,可初步鉴定出芹菜素6,8-二葡萄糖苷、木樨草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、山奈酚3-葡萄糖醛酸-7-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-D-吡喃葡萄糖醛酸糖苷、芹菜素-7-氧-葡萄糖醛酸苷等化合物.

大量文献将保留时间3.621 min核质比m/z 593的化合物归类为芹菜素7-O-咖啡酰葡萄糖苷,这与本试验结果不一致,对此,本研究对该化合物进行了详细分析.首先从质量数准确度的角度考虑,芹菜素7-O-咖啡酰葡萄糖苷的准确分子质量为m/z 594.137 3,分子式为C30H26O13,在质谱正离子模式下加合H离子的信号[M+H]+为m/z 595.144 6,负离子模式下[M-H]-m/z 593.130 1[10],这与本研究实际测得结果(594.158 5)差异较大,误差为35.68e-6.而芹菜素6,8-二葡萄糖苷的准确分子质量为m/z 594.158 5,分子式为C27H30O15,在质谱正离子模式下加合H离子的信号[M+H]+为m/z 595.165 7[10],这与本研究实际测得结果(594.158 5)一致,可信度较高.此外,该化合物的高分辨率质谱结果也得到了丰富的碎片离子信息,通过比较[10],该化合物的碎片离子与芹菜素6,8-二葡萄糖苷碎片离子基本一致,都有m/z 383、353、473、503等碎片离子,裂解规律也大致相同.

保留时间3.856 min色谱峰的准分子离子峰[M-H]-为 m/z 637.104 0,通过软件分析和数据库查询,对各色谱峰准分子离子与碎片离子的高分辨质谱数据进行分析,结合文献中紫苏植物化学研究结果,得到化学式为C27H25O18.在紫苏植物化学成分研究中[7,11],野黄芩素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、木樨草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷两化合物分子式都为C27H25O18,野黄芩素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷和木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷为一对同分异构体,拥有相同的碎片m/z285、351和193,[M-H-2(Glu-H2O)]-285.0397,[M-H-C15H10O6]-351. 055 6,[M-H-C15H10O6-C6H6O5]-193.035 0分别为苷元、2个葡萄糖醛酸离子及它们断裂形成的碎片[12].m/z 351为2个葡萄糖醛酸离子,由于葡萄糖醛酸含有羧基,使得其在负离子条件下有较强的响应.但本研究高能量质谱中存在m/z 175.025 2碎片,则可以将两者区分开来,m/z 175为木犀草素脱去邻羟基苯酚后的碎片离子,而野黄芩素没有此碎片,推断m/z 637.103 9为木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷.

保留时间4.241 min色谱峰的准分子离子峰[M-H]-m/z 621.109 3,数据库查询得到化学式为C27H26O17,此化合物低能量质谱中可检测到碎片离子m/z 351.056 3,高能量质谱中检测到碎片离子m/z 269.044 8、351.056 3、m/z 487、351和269等比较明显的碎片离子,其中m/z 487为[M-H-C8H6O2]-,为黄酮的特征断裂方式；m/z 351[M-H-C15H10O5]-351.2,为2个葡萄糖醛酸离子,由于葡萄糖醛酸含有羧基,使得其在负离子条件下有较强的响应,本研究中m/z 351丰度最高,响应最强.[M-H-2(Glu-H2O)]-269.2为芹菜素苷元.结合数据库信息,质谱碎片信息及文献报道[7,11,13],即可判断此谱峰为芹菜素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷.以上2个黄酮二葡萄糖醛酸苷类的低能量质谱中并未检测到高强度的黄酮苷元离子,而检测到较高能量的碎片离子 m/z 351.056 3,经数据库查询得到其化学式为C12H16O12,表明此片段为二葡萄糖醛酸离子.此碎片离子强度较高,可能与其结构中羧基易失去质子离子化有关.

保留时间4.077 min色谱峰的准分子离子峰[M-H]-为m/z 637.104 0,通过软件分析和数据库查询,对各色谱峰准分子离子与碎片离子的高分辨质谱数据进行分析,结合文献中紫苏植物化学研究结果,得到化学式为C27H25O18.521.189 8应该是丢失1个C4H6O3后形成的碎片；475.180 1应该是丢失C5H8O5后形成的碎片；285.039 4是丢失葡萄糖基和葡萄糖醛酸基后的母核碎片.根据以上信息,推测该化合物可能为山奈酚3-葡萄糖醛酸-7-葡萄糖苷或其同分异构体.

保留时间4.537 min,色谱峰的准分子离子峰[M-H]-为m/z 461.071 8,数据库查询得到其化学式为C21H18O12.产生m/z 285的二级碎片离子,即[M-H-176]-,根据池玉梅等[14]研究,推测失去1个葡萄糖醛酸残基；m/z 285的二级碎片离子产生m/z 257的三级碎片离子,这与标准品山奈酚的碎片离子相同,因此可以推断色谱峰准分子离子峰[M-H]-为m/z 461.071 8为山奈酚衍生化的黄酮糖苷.此化合物低能量质谱都可检测到碎片离子m/z 447.092 3、285.039 8,其中m/z 285.039 8在高能量质谱中丰度较高.通过数据库查询得到m/z 447.092 3化学式为C21H20O11,m/z 447.092 3失去1个葡萄糖残基162,产生m/z 285的二级碎片离子,推测为山奈酚-3-O-D-吡喃葡萄糖苷[15].结合前人研究[10]推测为山奈酚-3-O-D-吡喃葡萄糖苷酸,根据文献[16],推测该化合物为山奈酚-3-O-D-吡喃葡萄糖醛酸糖苷.

保留时间5.053 min,色谱峰的准分子离子峰[M-H]-为m/z 445.977 3,数据库查询得到其化学式为C21H18O11.此化合物低能量质谱中可检测到碎片离子m/z 269.045 2,高能量质谱中检测到碎片离子m/z 269.045 0,431.096 1,其中[M-H-176]-269.045 0,池玉梅等[14]研究表明,黄酮氧苷表现为丢失糖残基,如六碳糖苷、五碳糖苷、甲基五碳糖苷和六碳糖醛酸苷分别为丢失162、132、146和176 u,失去1个葡萄糖醛酸残基,且丰度较高.通过数据库查询得到m/z 269.045 0化学式为：C15H10O5,为芹菜素,m/z 431.096 1化学式为C21H20O10,为芹菜素-7-葡萄甙,通过前人研究[17]和质谱碎片信息,推测该化合物为芹菜素-7-氧-葡萄糖醛酸苷.

2.3 葵二酸的鉴定

紫苏提取物色谱分析中,在6.043 min检测到离子m/z 201.112 9,通过数据库查询得到此化合物分子式为C10H18O4,高能量质谱中碎片离子m/z分别为[M-H-H2O]-183.102 0、[M-H-H2O-CO2]-139.112 4、[M-H-CO2]-157.124 8、[M-H-CH2O2]-155.108 1.m/z 183.102 0是脱一分子水而产生,m/z 139.112 4是脱一分子水和一分子CO2而产生,m/z 157.124 8是脱一分子CO2而产生,m/z 155.1081是脱一分子CH2O2而产生,因此推断此化合物为葵二酸,这在紫苏文献中尚未找到,是推导出来的新化合物.

2.4 二次微波法与超声波协同微波法鉴定紫苏茎和叶化学成分比较

通过二次微波法和超声波协同微波法提取紫苏黄酮的负离子模式高分辨质谱总离子图(图1)和二次微波法和超声波协同微波法提取紫苏黄酮的液相色谱图(图2)分析,黄酮及其化合物主要集中在3.6 min到5.1 min内,5.1 min以后多为酚酸类.在质谱中,分子离子峰的相对丰度与化合物的结构密切相关.5.1 min以内,二次微波法提取紫苏黄酮的负离子模式高分辨质谱总离子相对丰度高于超声波协同微波法,说明二次微波法提取紫苏黄酮化合物形成的稳定性较超声波协同微波法的强,较不易发生裂变,但2种方法提取紫苏黄酮化合物形成的各个分子离子峰基本一致,即每个化合物基本一样；5.1 min以后,超声波协同微波法提取紫苏的酚酸类负离子模式高分辨质谱各离子相对丰度高于二次微波法,说明超声波协同微波法提取紫苏的酚酸类化合物形成的稳定性高于二次微波法,较不易发生裂变,而且2种方法提取紫苏的酚酸类化合物形成的各分子离子存在差异.二次微波法提取紫苏黄酮的液相色谱波峰吸光度显著高于超声波协同微波法(图2),而且有些液相色谱波峰不同,二次微波法提取紫苏黄酮的液相色谱波峰数多于超声波协同微波法.通过两者综合比对,二次微波法提取紫苏黄酮类化合物的效果优于超声波协同微波法,超声波协同微波法提取紫苏酚酸类化 合物的效果优于二次微波法.

3 讨论

本研究采用高分辨离子淌度液质联用技术(联合使用超高效液相色谱仪)和质谱仪(SYNAPT G2-Si HD英国沃特世),通过得到的紫外数据与高分辨质谱数据结合分析,再根据紫苏化学成分相关文献,从紫苏茎叶提取物中初步鉴定出10种化学成分.这些成分主要为酚酸与黄酮类化合物,其中葵二酸是采用高分辨离子淌度液质联用技术首次从紫苏中鉴定出的化合物.在黄酮类成分的质谱鉴定中,鉴定出2种含量较高的黄酮二葡萄糖醛酸苷类化合物.这类化合物的低能量质谱中,检测到较高强度的二葡萄糖醛酸碎片离子m/z 351.056 3,而仅检测到极弱的黄酮苷元碎片离子,因此提示此离子可能为黄酮二葡萄糖醛酸苷类化合物在负离子模式下的特征碎片离子.本研究鉴定的芹菜素6,8-二葡萄糖苷,与芹菜素7-O-咖啡酰葡萄糖苷结构相似,但通过分子质量数准确度和高分辨率质谱结果得到的丰富碎片离子信息等推断为芹菜素6,8-二葡萄糖苷,而不是芹菜素7-O-咖啡酰葡萄糖苷.野黄芩素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷和木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷为同分异构体,拥有相同的碎片m/z 285、351和193,但本研究高能量质谱中存在m/z 175.025 2碎片,则可以将两者区分开来,m/z 175为木犀草素脱去邻羟基苯酚后的碎片离子(285-110=175),而野黄芩素没有此碎片,推断m/z 637.103 9为木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷.中药材成分复杂,药材植物与产地、季节等自然因素有关,在药材采集储运等环节还存在着影响药材化学成分变化的因素.紫苏在世界范围内作为药食两用的植物药材,化学成分的变化必然会影响其药理活性与食用价值,因此在大规模地开发利用之前,应对其化学成分作进一步了解.本研究建立了一种基于高分辨离子淌度液质联用方法,用于紫苏茎叶提取物中化学成分快速分离与结构鉴定,可为该植物的合理利用与开发提供依据.

致谢：本论文研究工作在福建农林大学作物科学学院何水林教授实验室完成,特此致谢！