王 洁 周 兵

HER2(人类表皮生长因子受体蛋白2)在的浸润性导管癌中阳性表达，已经成为曲妥珠单抗的治疗靶点，并已广泛应用于临床，但因费用昂贵和心脏毒性等副作用一直在存在较大的争议[1]。因此，寻找乳腺癌新的治疗靶点正成为热点，GRB7(生长因子受体结合蛋白-7基因)作为与HER2一样同时位于17号染色体长臂上的1区2带-2区1带(17q12-21)的基因位点，被认为与乳腺癌的发生、发展存在密切的相关性。而在乳腺癌中有关于GRB7与HER2的关系国外研究得较少，国内鲜见相关报道[2]。现本文通过IHC与FISH法检测乳腺癌患者GRB7蛋白与HER2基因及蛋白表达，并探讨它们之间的相关性，为今后的乳腺癌患者治疗选择合适的个体化治疗方案提供分子理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集

选取九江市第一人民医院病理科2011年6月到2016年6月间，未经放化疗的乳腺浸润性导管癌存档组织标本110例为实验组，均为女性患者，年龄22～61岁，平均(44.2±2.7)岁。同时随机选取20例实验组的癌旁正常乳腺组织设为对照组。选取的对照组为实验组癌旁组织，存在可比性。

1.2 试剂及方法

IHC检测。GRB7鼠抗人单克隆抗体(工作浓度1:100)购于艾博康上海贸易有限公司。Her2为北京中衫金桥生物有限公司产品。所有乳腺癌蜡块标本均为临床、影像及高年资病理医生确诊，常规石蜡4 μm切片，按试剂盒说明逐步SP法免疫组化染色，实验组及对照组均采用同种处理方法，用PBS 液替代一抗作阴性对照，最后常规镜检。

FISH检测。HER2基因的检测试剂盒购自于北京金菩嘉公司，所有操作按照试剂盒步骤，白片组织脱蜡、脱二甲苯后，胃蛋白酶孵育15 min，再次洗涤、干燥后，加入10 μl探针，杂交仪中37 ℃过夜，72 ℃暗室干燥，加入10 μl DAPI显色液。正常乳腺组织和对照片同时作为阴阳对照，荧光显微镜镜检。

1.3 结果的判断

免疫组化判断依据美国临床肿瘤学会ASCO分级对HER2和GRB7行结果判读。HER2阳性呈棕黄色定位于包膜：肿瘤细胞膜染色占比≤10%、微弱不完整膜染色占比≥10%、弱完整膜染色占比≥10%、强完整膜阳性占比≥10%，分别计数(0～3+)。GRB7阳性呈棕黄色定位于包膜或胞质：肿瘤细胞染色阳性占比<5%、5%～25%、26%～50%、>50%，分别计数(0～3+)。

FISH结果判断依据美国临床肿瘤学会ASCO的HER2检测指南，根据试剂盒DNA探针说明，绿色信号为17号染色体丝粒(CEP17)，红色信号为HER2基因。随机计数30个肿瘤细胞，HER2/CEP17信号比≥2被认为阳性，即HER2基因存在扩增； HER2/CEP17信号比<2为阴性，HER2基因无扩增。

1.4 统计学方法

所有数据应用SPSS 18.0统计软件处理并行相关性分析，P<0.05认为统计学意义。

2 结果

2.1 HER2蛋白表达水平及基因扩增情况

免疫组化检测乳腺癌HER2表达评分0～1、2+和3+的病例占比分别为49.1%(54/110)、23.6%(26/110)和27.3%(30/110)，正常乳腺组织HER2不表达；FISH检测共计36例乳腺癌病例出现基因扩增,74例未扩增，与免疫组化HER2评分0～1、2+和3+符合率分别为0、30.8%和93.3%。HER2的免疫组化及FISH检测结构存在正相关性，相关系数γ=0.78(P<0.05)(表1)。

表1 HER2表达和扩增情况及相关性/例

2.2 GRB7蛋白表达及与HER2的相关性

110例乳腺癌标本中免疫组化方法检测GRB7表达评分0～1和2～3+的病例占比分别为51.8%(57/110)和48.2%(53/110)，正常乳腺组织表达1例占比为5%(1/20)。Her2表达与GRB7表达存在强相关性 (γ=0.83，P<0.05)(表2)。

表2 乳腺癌中HER2和GRB7表达的相关性/例

3 讨论

乳腺癌治疗主要以传统的手术、放化疗、内分泌治疗为主，近年来已明确了曲妥珠单抗为HER2+乳腺癌患者的治疗靶点，联合辅助化疗可以明显提高her2阳性乳腺癌的疗效[3]。但是未扩增的17号染色体HER2阴性，及转移性血清HER2阳性的乳腺癌患者预后仍不佳[4-5]，因此，针对乳腺癌细胞生物学特点与乳腺癌治疗及预后判定的靶点治疗成为当今乳腺癌研究的热点[6]。具有疗效好，毒副反应小的特点，能大大的提高病人的生活质量，降低死亡率。给目前乳腺癌的治疗提供了1个很好的方向。而乳腺癌的发生被证明与人类17号染色体存在密切关系。17号染色体由8100万个碱基构成，含有1500个基因片段，其DNA编码存在多片段重复性，参与了多种蛋白表达及基因编码[7]。尤其在位于17号染色体长臂上的1区2带-2区1带(17q12-21)的基因位点最为密集，有多个与乳腺癌表达相关的基因位点(HER2、GRB7、TOP2A、RARA、LASP1、STARD3等)，被认为与乳腺癌的发生、发展存在密切的相关性[8]。HER2为目前研究的比较透彻的一类具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白质，由结合区和胞内区组成。分子量约为185KD，包含23个氨基酸。被认为能促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡；并能通过上调(VEGF)/(VPF)削弱机体屏障，促进肿瘤内新生血管生长，从而增加恶性肿瘤的侵袭力[9]。GRB7(为最近发现的一类编码的多域的接头蛋白,含有535个氨基酸残基,有3种功能区域分别为富含脯氨酸的功能区N端、中间的GM区和位于C末端的SH2结构域[10]。人体内Grb7在胰腺中高表达，认为Grb7广泛参与表皮生长因子、成纤维细胞生长因子受体和胰岛素信号转导等各种信号转导通路，研究发现在很多肿瘤组织中，尤其是在侵袭的乳腺癌中GRB7蛋白处于高表达状态，其蛋白域相互作用及功能特异性有希望成为乳腺癌新的化疗靶点[11]。

本研究通过免疫组化方法测定110例HER2和GRB7蛋白表达状态，并应用FISH检测HER2 基因扩增的情况并初步探讨两者之间的关系。发现HER2免疫组化2+、3+阳性表达率占所有乳腺癌检查的50.9%，而GRB7免疫组化2+、3+阳性表达率占所有乳腺癌检查的48.2%，虽然HER2与GRB7在肿瘤细胞中的定位存在着一定的差异，但两者间显著阳性表达率相近，通过相关性分析发现γ=0.83，提示两者在免疫组化表达存在这明显的正相关，GRB7蛋白的表达可能依赖HER2的扩增与表达。有研究表明乳腺癌细胞在表皮生长因子的刺激下，与表皮生长因子受体结合的GRB7络氨酸被鳞酸化，并成为Ras-GTP酶的结合点，进而激活下游的ERK相关的信号通路，从而刺激肿瘤生长[2]。110例乳腺癌病理FISH检测结果显示基因扩增的共计36例，其基因扩增多见于HER2免疫组化2+、3+阳性病例。通过相关性分析发现γ=0.78，证实免疫组化及FISH检测结果存在强相关性，这与目前大多数学者已发表的研究结果类似，进一步明确HER2蛋白和基因的关系；本次研究通过初步探讨HER2与GRB7在乳腺癌中表达的关系，印证了乳腺癌HER2蛋白与基因扩增的一致性，且蛋白的表达依赖HER2的扩增与表达。同时显示HER2与GRB7在乳腺癌细胞中表达存在强相关性，提示GRB7在乳腺癌浸润、转移过程中发挥了重要作用，如抑制肿瘤细胞中GRB7的高表达，或许可以提高HER2抑制剂的抑制效果，GRB7可能会成为1个重要的靶分子，有效抑制肿瘤的转移、延长患者生命。

但本研究有一定局限性，GRB7的基因扩增未能完成，因有研究表面乳腺癌细胞内的GRB7基因与mRNA转录水平及基因的拷贝数密切相关，进而促进癌细胞蛋白表达[8]。这将是我们接下来的研究方向，明确GRB7蛋白的作用，构建出GRB7参与细胞信号完整通路，为肿瘤的靶向治疗提供新的方向。