胡 叶 周 琴 李善君 冯宝约 杨 莹 左明焕

肿瘤生长与转移有赖于血管生成。血管生成是一个多因素参与、多步骤复杂的过程，它与肿瘤细胞、血管内皮细胞均密切相关[1]。VEGFR-2做为VEGF受体，主要与调控血管生成有关。VEGF/VEGFR-2构成调控肿瘤血管生成的关键信号传导途径[2]。

华蟾素注射液是由中华大蟾蜍阴干的全皮中提取制成的水溶性注射液。实验研究表明，华蟾素具有提高患者免疫力、抑制肿瘤细胞生长等功能[3]。本文通过四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、倒置荧光显微镜实时成像技术和酶联免疫(ELISA)实验，对比观察华蟾素注射液对血管内皮细胞和肿瘤细胞生长状况和VEGF表达的影响，探讨华蟾素注射液抑制恶性肿瘤血管生成的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)一株，购自ATCC细胞库。HUVEC使用Endothelial cell medium(ECM)完全培养基(内含 5% 胎牛血清、10 μl/ml ECGS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素)。人结肠癌SW480细胞系购于中国科学院细胞库。SW480细胞使用DMEM完全培养基内含(10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素)。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞经胰酶消化、传代和收获，取对数生长期细胞用于研究。包装细胞PT-67 RFP，包装细胞PT-67 H2b GFP 由安泰康生物技术有限公司构建提供。

1.2 药品和试剂

华蟾素注射液(5 ml，500 mg/ml)购自安徽华润金蟾有限公司，用时使用对应细胞完全培养基稀释至所需浓度。Endothelial cell medium(ECM)培养基套装购自ScienCell，PBS购自CORNING公司，0.05%胰酶、胎牛血清购自Gibco公司，DMSO、MTT购自Amresco公司，Geneticin(G418 Sulfate)购自Gibco，Hygromycin B购自Invitrogen，Human VEGF HUMAN ELISA Kit 购自eBioscience公司，Human VEGFR-2 Elisa BMS2019 购自eBioscience公司。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期的细胞，胰酶消化后进行细胞计数，以4×103个/孔接种于96孔板中，用培养液定容至总体积200 μl，细胞贴壁后更换培养基，加入待测药物，分为空白对照组、华蟾素组，每个浓度设置6个平行复孔，分别于加药后24 h、48 h、72 h进行MTT 检测，每孔加入20 μl的MTT溶液，CO2培养箱孵育4 h后，去上清，加入100 μl/孔DMSO溶液，充分溶解后，在酶标仪上测定570 nm处的OD值。

1.4 倒置荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化

1.4.1 双色荧光细胞的转染与筛选 稳定转染双色荧光细胞，即细胞核稳定表达绿色荧光蛋白(GFP，green fluorescent protein)，细胞质稳定表达红色荧光蛋白(RFP，red fluorescent protein)，是通过将绿色荧光蛋白特异性转入已有的表达RFP细胞的细胞核中进行稳定表达。将包装细胞 PT-67 H2b RFP 培养至对数期，收集培养4 h的新鲜上清液，0.22 μm滤膜过滤后，分别对两种细胞进行2～4次转染，48～72 h后可见部分细胞质表达红色荧光蛋白，用50、100、200 μg/ml潮霉素B及400、800、1 000 μg/ml的G418进行筛选。1～2周后选取双色细胞比例大，细胞状态好的组进行单克隆筛选，以1 cell/孔接种96孔板，1周后寻找有单克隆形成的孔，待细胞数量>200 cell时，进行消化扩培，选取荧光最亮的克隆保种得到HUVE RFP和SW480 RFP。然后将对数期的包装细胞PT-67 H2b GFP收集上清并过滤，分别对HUVE RFP和SW480 RFP进行转染，转染、筛选及单克隆方法同上，最终得到双色荧光转染的HUVEC细胞(HUVEC DUAL)和双色荧光转染的SW480细胞(SW480 DUAL)。

1.4.2 荧光显微镜下形态学观察 将双色荧光细胞培养至对数期，0.05%胰酶消化收集细胞并计数，以细胞数4×103cell/孔体积200 μl接种于96孔细胞培养板，贴壁过夜后上样，分别设置空白对照组及华蟾素组，每个浓度设3个平行孔，CO2培养箱孵育0，24 h，48 h，倒置荧光显微镜进行成像，观察细胞形态。

1.5 酶联免疫法(Elisa)检测 VEGF、VEGFR-2 表达

1.5.1 Elisa法检测VEGF表达 取空白对照组及华蟾素组干预48 h后的细胞上清液，1 000 r/min 离心20 min再取上清，严格按照VEGF HUMAN ELISA Kit试剂盒说明操作，将不同浓度的VEGF标准品以及不同组的细胞上清液于酶标仪中检测450 nm吸光度值和上清中VEGF吸光度值，计算VEGF含量。

1.5.2 Elisa法检测VEGFR-2表达 将空白组及华蟾素组干预48 h后的细胞上清弃掉，加细胞裂解液，离心后取上清，按照Human VEGFR-2 Elisa BMS2019说明操作，将不同浓度的VEGFR-2标准品以及不同组的细胞上清液于酶标仪中检测450 nm吸光度值和上清中VEGFR-2吸光度值，计算VEGFR-2含量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 华蟾素注射液对HUVEC细胞增殖的影响

3个浓度的华蟾素组与对照组相比，培养24 h OD值均无明显差异，培养48 h后有3组OD值低于正常对照组(P<0.05)，72 h后华蟾素的抑制作用减弱，仅2组低于对照组(P<0.05)。表明在实验浓度范围内，培养24 h 华蟾素对正常内皮细胞的生长无明显作用，48 h表现出对HUVEC的最大抑制作用，72 h时抑制作用减弱，见表1。

2.2 华蟾素注射液对SW480细胞增殖的影响

MTT法结果显示，华蟾素能显著抑制 SW480 细胞的生长增殖能力，且呈一定的量效与时效关系。作用24、48及72 h后，高剂量华蟾素浓度组与空白对照组有统计学差异。可见药物浓度越高，作用时间越长，华蟾素对SW480细胞的抑制作用越强(表2)。

表1 华蟾素处理HUVEC细胞的 OD值

注：*为与空白对照组同期相比，P<0.05；**为与空白对照组同期相比，P<0.01。

表2 华蟾素处理HUVEC细胞的 OD值

注：*为与空白对照组同期相比，P<0.05；**为与空白对照组同期相比，P<0.01。

2.3 不同浓度的华蟾素干预HUVEC细胞形态对比

随着华蟾素浓度的增高和时间的延长，内皮细胞的增殖受到抑制，但未见明显的细胞核异常，没有明显诱导内皮细胞凋亡的作用。

2.4 不同浓度的华蟾素干预SW480细胞形态对比

华蟾素对人结肠癌细胞SW480有明显的增殖抑制、诱发凋亡的作用，并且随着时间延长和浓度增加，抑制增殖和促进凋亡的作用越强。

2.5 HUVEC细胞中VEGF及其受体含量变化

通过VEGF Elisa试剂盒测定华蟾素组(0.01 mg/ml、0.1 mg/ml、1 mg/ml)实验表明不同浓度的华蟾素注射液不能抑制HUVEC细胞分泌的VEGF，各浓度组间无统计学差异。而HUVEC细胞膜表面VEGFR-2在华蟾素作用下降低，降低差异有明显统计学意义，说明华蟾素呈浓度依赖性抑制HUVEC细胞表面的VEGFR-2，但对细胞表达的VEGF无影响，见表3。

表3 华蟾素干预HUVEC细胞48 h后VEGF及VEGFR-2表达情况

注：*为与空白对照组同期相比，P<0.05；**为与空白对照组同期相比，P<0.01；△为与华蟾素其他浓度组同期相比，P<0.01。

2.6 SW480细胞中VEGF及其受体含量变化

通过VEGF Elisa试剂盒测定华蟾素组(1 mg/ml、10 mg/ml、100 mg/ml)作用48 h后VEGF蛋白的表达量分别是：(271.10±0.32)pg/ml，(240.99±18.63)pg/ml，(207.76±18.97)pg/ml，与空白对照组(285.65±31.12)pg/ml相比，差异有统计学意义(P<0.05)。VEGFR-2在不同浓度华蟾素注射液的变化趋势与VEGF相似。说明华蟾素呈浓度依赖性抑制 SW480 细胞表达VEGF及VEGFR-2，见表4。

3 讨论

恶性肿瘤生长与转移有赖于血管生成，恶性肿瘤血管在细胞组成、组织结构及功能特点上与正常血管有明显差异。例如，肿瘤血管管壁并非由单一的内皮细胞层构成，单纯肿瘤细胞或肿瘤细胞与内皮细胞之间均可形成血管壁内层细胞。此外，研究表明，抑制正常组织血管生成的调控机制并不能控制肿瘤血管生成[4]。

华蟾素是1种具有抗肿瘤作用的传统中药，在临床中得到了广泛应用[3]。 袁莉等[5]分析102例接受华蟾素灌注的恶性腹水患者，有效率为65.7%，并显示华蟾素能使恶性腹水颜色由红色转为淡黄色。左明焕等[6]对湿热型恶性腹水患者60例进行研究，结果华赡素腔内灌注组优于白介素-2腹腔灌注组。孙韬等[7-8]使用华蟾素注射液灌注治疗晚期肺癌恶性心包积液可有效控制其增长，毒副作用小，可耐受，一定程度上能够改善患者的生活质量并延长生存。刘传波等[9]发现华蟾素膀胱灌注联合血凝酶可有效控制膀胱癌血尿，减少膀胱出血，改善患者生活质量。可见，华蟾素在机体体内能够有效抑制恶性肿瘤血管的产生和增殖。

表4 华蟾素作用SW480细胞48h后VEGF及VEGFR-2表达情况

注：*为与空白对照组同期相比，P<0.05；**为与空白对照组同期相比，P<0.01。

本研究通过体外实验，观察肿瘤细胞和血管内皮细胞在华蟾素注射液干预下的细胞生长抑制情况时发现，在有效治疗剂量范围内，华蟾素能够有效抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡；对于正常血管内皮细胞，华蟾素的作用仅表现为一过性的抑制，同时不能诱导内皮细胞的凋亡。VEGF及其受体表达方面，华蟾素有效降低肿瘤细胞表达VEGF蛋白含量，且该抑制作用呈量效性和实效性；同时华蟾素能够抑制正常血管内皮细胞膜VEGFR-2受体的表达，但对血管内皮细胞表达的VEGF无明显抑制作用。由此，课题组推断华蟾素能够选择性作用于肿瘤细胞及恶性肿瘤血管，抑制其生长和增殖，同时不会引起正常血管细胞的损伤，是一种潜在抗肿瘤血管生成的药物，其作用机理可能是阻断了肿瘤细胞所表达VEGF与正常内皮细胞膜表面的VEGFR-2受体结合，抑制肿瘤新生血管生成。

目前，用于肿瘤治疗的药物大多数缺乏肿瘤细胞靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤大量骨髓及其他正常的增殖旺盛细胞，产生严重的不良事件，使病人难以承受。现临床常用的抗肿瘤血管药物作用机理多为干扰或阻断单一1个因子涉及的途径，虽然可以抑制肿瘤的血管生成，但容易诱发肿瘤援救反应，难以达到令人满意的治疗效果[10]。华蟾素作为中药制剂，能够多靶点、多系统的对抗恶性肿瘤血管的生成和增殖，其疗效显著，毒副作用小，耐受性强，适于临床推广，其抗肿瘤血管生成的机理仍需进一步研究和完善。