张晋 袁哲

与骨髓来源干细胞相比，脐带血造血干细胞具有获取快速、来源广泛、供者风险低、移植物抗宿主病发生率低等优点，脐带血移植已被广泛用于治疗多种血液系统疾病[1]。然而，由于细胞总数有限，脐带血造血干细胞移植并不适合用于年龄较大的患者。在临床应用中，有核细胞总数（total nucleated cells，TNC）是脐带血供体选择的主要依据，而脐带血采集量和每单位体积的白细胞计数是决定TNC大小的关键指标。本研究回顾分析了389例脐带血样本的TNC和采集量以及影响二者的母婴因素和采集处理因素，旨在优化脐带血的采集和实验室处理流程，从而提高脐带血的保存质量。

材料与方法

一、材料

1.脐带血采血袋：一次性使用塑料血袋（规格型号为200 ml，山东威高公司），血液保存液（含量为28 ml，成份为枸橼酸、枸橼酸钠、磷酸二氢钠、葡萄糖及腺嘌呤，批号为14101821，生产日期为20141018，有效期为201609，经高压蒸汽灭菌、无菌、无热源、一次性使用）。本研究为回顾性分析，所有数据均来自计算机系统。不论是自体保存还是公共捐献， 389 份脐带血在采集之前均获得产妇/家属的知情同意并签订了保存/捐献协议。

2.脐带血采集对象：采集之前必须获得产妇/ 家属的知情同意，详细询问产妇的病史、妊娠史、传染病史和遗传病史并检查各项检验结果；产妇年龄不小于18岁，孕龄不少于36周，无传染性疾病，无恶性肿瘤及遗传性疾病，无血液系统疾病及免疫系统疾病，妊娠期间无严重合并症等；胎儿体重大于2 500 g，无畸形，无窒息、水肿、黄疸、感染；凡不符合以上要求者均应排除在采集对象之外[2]。

3. 389份脐带血的平均采集量为75 ml（30 ～170 ml）；TNC 数平均为 6.6，TNC 最小者为 2.1，最大者达28.3。母婴因素中，母亲平均年龄32岁；平均孕龄39周；新生儿平均体重3 399 g，最大为4 700 g，最小为2 500g；剖宫产为主要分娩方式，占69.9%；新生儿中男性偏多，占52.4%；产妇中多数为第1胎，占50.4%，少数为第2胎和第3胎。采集处理因素中，采集至计数间隔最短为1 h，最长为45 h；采集方式有第三产程采集、体外采集以及两种方式混合采集，但以第三产程采集为主，占76.1%。

二、实验方法

1.脐带血采集：参照《脐带血造血干细胞库技术规范》和纽约脐带血库Rubinstein等[3]的分离方法，胎儿娩出后，在近胎盘端对脐带穿刺部位进行严格消毒，将采血针于止血钳固定部位上端5 cm处快速刺入脐静脉，使脐带血通过重力作用流入一次性采血袋内，同时轻轻摇晃采血袋，使脐带血和保存液充分混匀，直至采集结束。采集后放于4 ℃冰箱保存并在48 h内完成细胞计数和分离冷冻。

2.脐带血处理及冷冻：参照纽约脐带血库Rubinstein等[3]的分离方法并结合实际经验，根据白细胞、红细胞和血浆密度不同的特性，将6%羟乙基淀粉生理盐水溶液与脐血以1 : 5比例加入脐带血血袋中，通过四步离心将富含有核细胞的白膜层分离提取，并于15 min内将冷冻保护剂[细胞内保护剂采用二甲基亚砜（DMSO），细胞外保护剂采用低分子右旋糖酐，二者等体积混合，使DMSO终浓度为10%]加入装有白膜层的冷冻袋中，程序降温后置于-196 ℃液氮中保存。

3. TNC检测：轻轻摇晃使脐带血充分混匀，无菌技术抽取0.5 ml，使用KX-21型全自动血液分析仪（日本SYSMEX）进行细胞计数。检测用稀释液、溶血剂和清洁液均为SYSMEX配套试剂；各项操作均遵守实验室标准操作规程；每次开机后测定配套质控品，结果合格后方可进行常规检测；定期参加卫生部临床检验中心组织的室间质量评价并全部通过。

三、统计学分析方法

采用 SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。脐带血采集量与新生儿体重的相关性分析采用Pearson相关，而与母亲年龄、孕龄、采集至计数间隔、TNC的相关性分析采用Spearman秩相关；TNC与母亲年龄、孕龄、新生儿体重、采集至计数间隔和TNC的相关性分析均采用Spearman秩相关。孕龄、分娩方式两组间采集量比较采用两样本t检验，新生儿性别两组间采集量比较采用Mann-WhitneyU检验，新生儿体重、胎次、采集方式多组间采集量比较采用Kruskal-WallisH检验；脐带血采集量、孕龄、分娩方式、新生儿性别两组间TNC比较采用Mann-WhitneyU检验，新生儿体重、胎次、采集方式多组间TNC比较采用Kruskal-WallisH检验。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、相关性分析

脐带血采集量与TNC显著相关（r= 0.723，P＜ 0.001）；母亲年龄与采集量及TNC均无显著相关；孕龄与采集量负相关（r= -0.119，P= 0.019），而与TNC正相关（r= 0.138，P= 0.007）；婴儿出生体重与采集量及TNC均显著正相关（r= 0.236,P＜0.001；r= 0.275，P＜ 0.001）；脐带血采集至计数的时间间隔与采集量及TNC均无显著相关（表1）。

表1 脐带血采集量及TNC与母婴及采集处理因素相关性分析

二、分组比较

TNC随着脐带血采集量的增加而增加，差异具有统计学意义（P＜ 0.001）；按是否足月，将孕龄分为＜ 37周和≥37周，随着孕龄的延长，TNC增加（P= 0.038）而脐带血采集量并无变化；在婴儿出生体重方面，脐带血的采集量和TNC均随出生体重的增加而增加（P＜ 0.001）；剖宫产的脐带血采集量虽高于阴道分娩（P＜ 0.001），但其 TNC 不及阴道分娩；在婴儿性别方面，男婴与女婴在脐带血采集量和TNC之间无差异；产妇胎次数与脐带血采集量和TNC之间无相关性；采用单一方式采集的脐带血，在采集量和TNC之间无差异，但均高于采用混合方式采集的脐带血（表2）。

表2 母婴及采集处理因素对脐带血采集量及TNC的影响

讨 论

脐带血造血干细胞移植有着广阔的临床应用前景，临床中评价移植用脐带血质量的常用指标为TNC以及由此计算的CD34+细胞总数和集落总数，而TNC的大小主要取决于脐带血采集量和每单位体积白细胞计数值。本研究对评价脐带血保存质量的采集量和TNC进行了影响因素的相关性分析和分组探讨，其中母婴因素包括母亲年龄、孕龄、新生儿出生体重、分娩方式、新生儿性别以及怀孕胎次，采集处理因素包括脐带血采集至计数的时间间隔以及脐带血的采集方式。

脐带血采集量通常被作为脐带血处理前是否废弃的直接标准，2011年对5910份脐带血废弃原因的调查发现，高达30%的脐带血因采集量不足被废弃[4]。有研究显示，脐带血采集量与反映脐带血重建造血潜能的TNC、CD34+细胞总数和集落总数均具有明显相关性，采血量越多，TNC值越高，能够满足的高体重患者数越多，库存脐带血的利用率就越高[5]。本研究中脐带血采集量与TNC呈显著正相关，随着采集量的增加，TNC数呈稳定上升，说明采集技术是影响脐带血质量的关键因素。为提高库存脐带血的TNC，以适合更多更大体重的患者使用，实际工作中应优化脐带血的采集方法（第三产程或体外采集）或通过设定更加合理的采集对象标准（出生体重较大婴儿），从而提高脐带血的采集量，这与罗晓菊等[6]研究结果相同。

在母婴因素中，孕龄与TNC呈正相关，TNC随孕龄的延长而增加，这可能与胎儿体重随孕龄增加有关，这一结果与Robert等[7]结果基本一致。婴儿出生体重与脐带血采集量和TNC均呈明显正相关，将体重按照每增加500 g分为4组，随着体重的增加，脐带血采集量和TNC均呈稳定上升趋势，说明婴儿出生体重是影响脐带血质量的关键因素，这与吴洁莹等[8]报道的婴儿体重是预测脐带血造血潜能重要指标的结果一致。以往研究认为，阴道分娩可能通过应激反应、压力作用等刺激细胞因子分泌增加从而导致脐带血中含有较高数量的原始细胞[9]，本研究中经阴道分娩的脐带血TNC虽高于剖宫产，但无统计学差异，这可能与分娩方式的构成比例不同有关。近年来我国的剖宫产数量逐年增加（本研究中高达70%），其中相当一部分产妇未达到自然孕龄或缺乏医学指征，这些因素都可能导致有核细胞计数低于正常状态的阴道分娩。今后研究若扩大标本数量，其结果对评价分娩方式尤其是阴道分娩对脐带血TNC含量影响的意义会更大。与男婴相比，女婴的脐带血TNC数量略有增加，这与吴洁莹等[8]报道一致，但二者差异无统计学意义，可能与本研究标本数量较少有关。

在采集处理因素中，第三产程采集法即体内采集法，即待胎儿娩出后，立即用止血钳夹住脐带，使用碘酒消毒后进行脐静脉穿刺，一般可在胎儿娩出10 s内获得脐带血，而体外采集法为待胎盘剥离后再进行脐带消毒和脐带血采集[10]。与体外采集法相比，第三产程采集因采集及时可获得较多血量，但本研究并未发现两者在采集量上存在统计学差异，可能和本研究纳入的标本数量较少有关，但采用单一方式获得的脐带血量和TNC均高于采用混合方式采集的脐带血。

综上所述，该研究通过分析母婴因素及采集处理因素对脐带血采集量和TNC的影响，为临床合理选择采集对象以及实验室有效改进操作方法提供了重要的参考依据。研究结果提示为了提高脐带血产品的保存质量，减少不必要的资源浪费，应侧重选择孕龄较长、胎儿体重较大、经阴道分娩的产妇作为脐带血的提供者，同时实验室应首先处理采集量较大的脐带血。