陈俊秋 陈津 黄梁浒 赵红州 付云烽 林娜 朱凌峰 程远航 王水良谭建明

胰岛移植是治疗糖尿病的有效方法[1]。2000年Shapiro等[2]首次报道临床同种异体胰岛移植，使1 型糖尿病患者完全脱离胰岛素。根据国际胰岛移植随访结果显示，胰岛移植可以改善血糖水平，1年后57%的患者摆脱胰岛素依赖[3]。然而胰岛移植效果在一定程度上受到移植胰岛血管生成障碍所限制[4]。胰岛属内分泌组织，分泌的激素直接释放入血，因此是一个高度血管化的组织细胞团，其周围的毛细血管网比外分泌组织的密度大5倍。丰富的毛细血管网络为胰岛提供信号、营养物质和氧气等，维持胰岛存活和胰岛功能[5-6]。异体胰岛移植后，由于新血管尚未生成，无血管期的胰岛因缺血、缺氧等引起胰岛细胞大量凋亡[7]。此外高浓度的免疫抑制药物的使用也影响胰岛新血管的生成[4]。因此，提高移植胰岛血管生成能力对提高胰岛移植效果具有重要的意义。

间 充 质 细 胞（mesenchymal stem cells，MSC）在体内外均能延长胰岛的存活时间，起到保护胰岛的作用，但是机制尚未明确[8]。MSC外泌 体（Exosomes） 是 由MSC分 泌 的 直 径 为30 ～ 100 nm的微小膜泡，具有脂质双层结构，可以携带MSC的膜蛋白、胞内蛋白、mRNAs和miRNAs，影响靶细胞的许多病理生理功能，如抑制免疫细胞增殖和活性，促进血管生成等[9-10]。MSC外泌体是否能促进胰岛血管生成，进而提高移植胰岛存活率，还尚未见到相关报道。本研究以小鼠胰岛内皮细胞MS-1为模型，探讨低氧条件下，MSC外泌体对小鼠胰岛血管生成的影响。

材料与方法

一、材料

DMEM高糖、低糖培养基、0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清（美国Hyclone公司）；超滤离心管（3 kDa，美国Millipore公司）；Matrigel胶（美国BD公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司），磷酸酶抑制剂（美国ROCH公司），蛋白酶抑制剂（美国Millipore Calbiochem 公 司）；鼠 抗 β-actin、CD63、CD81，兔抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、HIF1-α、CD9、Flotilin 1 抗体（美国Abcam公司）；兔抗p-mTOR、mTOR抗体（美国CST公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（美国Thermo公司）；ECL显色液（美国Thermo公司）；碳膜支持铜网、磷钨酸染液（中佳科镜公司）。

二、方法

1.细胞培养：人脐带MSC由福建省干细胞应用工程技术研究中心提供，采用含胎牛血清10%的低糖DMEM培养基，按照本实验室的培养方法进行培养[11]。胰岛内皮细胞MS-1购自中国科学院上海细胞库，细胞培养在含5%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，隔天换液。

2. MSC条件培养基制备及外泌体的提取：取生长至80%～ 90%的第4代MSC细胞，弃去培养基，PBS洗涤2遍，加10 ml无血清培养基，放入培养箱中，37 ℃、2 % O2、5%CO2低氧培养48 h， 1 200×g离心10 min去除细胞碎片。上清液用0.22 μm的抽滤器过滤后加入超滤管上柱中，4 000×g离心60 min，吸取超滤管内富集的外泌体，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。

3.外泌体鉴定：吸取 10 ～ 15 μl外泌体吸附于碳膜支持铜网上，磷钨酸染液负染1 ～ 2 min，PBS洗涤后晾干，透射电镜下观察外泌体形态大小。取30 μg外泌体高温变性后加样电泳并转至PVDF膜，Western Blot方法检测外泌体标志物CD9， CD81，CD63，Flotilin1的表达。

4.体外血管形成试验：Matrigel胶4 ℃冰箱融化后加入到预冷的96孔板中，每孔分别加入MS-1细胞2×104个。低氧+外泌体组（HYP+EXO）每孔加入 10 μg/ml外泌体，常氧对照组（NOR）和低氧组（HYP）分别加入等体积PBS。NOR组放入37 ℃、5 % CO2、21%O2的常氧培养箱培养，HYP和 HYP+EXO 组放入 37 ℃、2 % O2、5 % CO2的低氧培养箱培养；培养24 h后，观察血管网形成情况，并用Image J软件进行分析。

5.细胞mRNA提取及PCR分析：按照本实验室常用的方法[12]，提取各组MS-1细胞总RNA，经RNA定量后，反转录成cDNA，分别用Q-PCR和常规PCR方法检测VEGF等血管形成相关基因的表达情况。PCR引物序列如下：VEGF（上游：5'-CACGACAGAAGGAGAGCAGA-3'；下 游：5'-CAGGGCTTCATCGTTACAGC-3'）。 常 规 PCR结果通过1%琼脂糖凝胶电泳观察结果；Q-PCR结果以各自β-actin为内参，以常氧组为对照，计算2-△△ct值为基因相对表达倍数。

6. Western Blot检测VEGF及相关信号分子的表达：MS-细胞分为NOR组、HYP组和HYP+EXO组，平行培养24 h后，用100 μl裂解液刮下细胞，冰上裂解 10 min，4 ℃、12 000×g离心 30 min，取上清液作为蛋白样本，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。取30 μg蛋白高温变性后加样电泳并转至PVDF膜，4 % BSA封闭1 h，加入兔抗鼠VEGF、p-mTOR、mTOR、HIF1-α一 抗（1 : 2 000稀释）或β-actin内参一抗（1 : 5 000稀释），4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次后，加对应的二抗孵育1 h， TBST洗涤3次后加入ECL发光液暗室曝光成像。

三、统计学分析方法

采用Graphpad Prism 6.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNK-q检验。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MSC外泌体分离鉴定结果

收集MSC低氧条件培养基，经超滤离心法富集后，获得MSC培养上清液中的外泌体。经磷钨酸负染，透射电镜检测，获得的外泌体直径大小为30 ～ 100 nm 的微粒（图 1）。经 Western Blot检测，所获得的外泌体表达CD9，CD63，CD81等外泌体标志物（图 2）。

图1 电镜下观察外泌体的形态大小（磷钨酸负染，×50K）

图 2 外泌体标志物Western Blot检测鉴定

图 3 倒置相差显微镜下观察MSC外泌体促进胰岛内皮细胞MS-1血管形成（×100）

二、MSC外泌体对小鼠胰岛内皮细胞血管形成的影响

体外血管形成试验结果显示，常氧条件下，胰岛内皮细胞MS-1未见明显的血管网形成；低氧条件下，低氧对照组可见少量网状形成；而加入外泌体组可见大量血管网形成（图3）。经Image J分析，常氧组、低氧组、低氧加外泌体组的血管形成相对长度分别为（393.30±174.20，1467.00±230.00，2386.00±137.70）像素。低氧条件下，胰岛内皮细胞MS-1较常氧对照组相比，血管形成能力增加（t=4.874，P= 0.0396），而低氧加外泌体组与常氧对照组和低氧组相比，血管形成能力均提高（t= 12.30，P= 0.0065；t= 15.74，P= 0.0040，表 1）。

三、MSC外泌体上调胰岛内皮细胞VEGF表达

常规PCR结果显示，低氧条件下，MS-1细胞VEGF表达上调，MSC外泌体明显提高低氧条件下MS-1细胞VEGF基因的表达（图4a，表1）。Q-PCR定量结果显示，与常氧对照组（VEGF相对表达量为1.000）相比，低氧组VEGF相对表达量增高（6.52±3.50），差异有统计学意义（t= 4.461，P= 0.0029）；低氧加外泌体组VEGF相对表达量为（20.26±9.972），较常氧对照组和低氧组相比VEGF的表达量均明显提高（t= 5.462，P= 0.0009；t= 4.238，P= 0.0038）。Western Blot结果也证实，在蛋白水平，MSC外泌体组VEGF表达也明显增高（图 4b）。

四、MSC外泌体上调HIF1-α和促进mTOR发生磷酸化

在含氧量正常的条件下，HIF1-α被蛋白酶迅速降解；在低氧条件下，HIF1-α可稳定表达。加入MSC外泌体后，HIF1-α表达显著上调。同时还发现，mTOR信号通路在低氧时发生磷酸化，MSC外泌体可显著增强mTOR信号通路的磷酸化。（图5）

表1 Image J血管形成长度分析和VEGF相对表达量

图 4 MSC外泌体上调血管内皮生长因子基因表达

图5 MSC外泌体上调HIF1-α表达和促进mTOR发生磷酸化

讨 论

外泌体是直径30 ～ 100 nm的脂质双分子层包裹有蛋白质和核酸的小囊泡[9]，是细胞外膜微囊结构重要组成部分[13]。外泌体可以在培养细胞的上清液中，以及许多类型体液中分离得到。MSC可以释放外泌体，尤其是在低氧环境下MSC能释放出大量的外泌体[14]。本研究中通过低氧条件培养MSC，通过超滤离心法，成功的富集MSC条件培养上清液中的外泌体。经鉴定大小为30 ～ 100 nm，表达CD9，CD63，CD81等外泌体标志物[15]。

MSC来源的外泌体具有多种MSC的生物活性。MSC外泌体具有免疫抑制的作用，可以抑制T 细胞增殖和诱导CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞增殖，增强异体皮肤移植存活[16]；可以促进异体移植物存活和诱导供体特异的异体移植物免疫耐受[17]。近年来研究发现，MSC及其来源的外泌体可以介导调节血管生成[18-19]。MSC来源的外泌体含有丰富的促血管生成作用的效应分子，如血小板衍生生长因子，表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子等，可通过激活NFκB信号通路调节血管生成[20]。一些研究者也在肾缺血再灌注和心肌损伤修复中证实了MSC膜微囊具有促进血管再生的作用[21-22]。本研究证实了MSC外泌体在低氧条件下，能够促进胰岛内皮细胞MS-1分化形成血管。进一步研究发现，MSC外泌体能够上调MS-1细胞HIF1-α和VEGF的表达水平，并激活mTOR信号通路。

HIF1-α可调节多种血管生成因子的表达如促红细胞生成素，表皮细胞生长因子，基质金属蛋白酶和血管生成素2等。在含氧量正常的条件下，HIF1-α被蛋白酶迅速降解；而在低氧条件下，可通过限制脯氨酰羟化酶的活性从而抑制HIF的羟基化，稳定HIF1-α的表达[23]。VEGF是在内皮细胞中分离和鉴定出来的特异性有丝分裂原，具有诱发血管再生的能力。在血管再生过程中发挥重要作用。它可以刺激血管内皮细胞增殖和迁移，增加血管的通透性[24]。VEGF与VEGFR结合后，可以通过激活PLCr-mTORC1信号通路，调节ATF6和PERK表达，促进内皮细胞存活和血管生成[25]。

本研究结果表明，在体外细胞实验中，MSC外泌体可促进低氧条件下的小鼠胰岛内皮细胞血管生成。MSC外泌体有可能通过上调HIF1-α，调节VEGF表达，激活mTOR信号通路，促进胰岛内皮细胞血管生成。