张梦阳 张光霁 楼招欢

浙江中医药大学 浙江 杭州 311400

丹参二萜醌(DT)是从中药丹参（唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge根）中经超临界萃取、高速逆流色谱纯化而得富含隐丹参酮和丹参酮ⅡA的有效部位[1]。前期研究发现DT具有良好的抗肺癌作用，可通过内质网应激介导的凋亡途径促进肺癌细胞凋亡[2]，但其抗肺癌作用机制尚需进一步深入研究。研究发现很多癌症发生在感染、慢性刺激和炎症部位，虽然炎症与肿瘤发生之间的机制尚不十分明确，但炎症微环境对于肿瘤发生发展至关重要[3]。本文拟通过观察丹参二萜醌对肺癌荷瘤裸鼠血清炎症因子水平等的作用，从肿瘤炎症微环境角度，阐述丹参二萜醌抗肺癌作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料：分述如下。

1.1.1 细胞株及动物：人肺腺癌PC9细胞由浙江省中医院中心实验室提供；健康裸鼠，5周龄，雄性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号码SCXK（沪）2008-0016；小鼠饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心SPF级小鼠饲养室，温度22±1℃，湿度50%～70%。于实验前适应性喂养1周，自由摄食、饮水。

1.1.2 药品与试剂：取丹参二萜醌适量，加入适量吐温研磨后加纯水稀释成混悬液。TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器：SERIESII WATER JACKET CO2细胞培养箱，美国Thermo公司；SW-II ALB3型超净工作台，上海上净净化设备有限公司；VARIOSKAN FLASH多功能全波长酶标仪，美国Thermo公司；al204电子天平，上海托利多仪器有限公司；MoorFLPI散斑全帧实时扫描成像系统，英国Moor公司。

1.2 实验方法：分述如下。

1.2.1 细胞的培养及接种：取液氮冻存的人肺腺癌PC9细胞，将冻存管置于37℃的水浴锅中迅速晃动使细胞溶解，将细胞及培养液吸入备好的离心管（内含5ml备好的10%FBS的DMEM培养液）中，800rpm/min，离心5min，弃上清，加入1ml 10%FBS的DMEM培养液，轻轻吹打细胞使其均匀，将人肺腺癌PC9细胞转移至培养瓶中，放置于饱和湿度、5%CO2、37℃的细胞培养箱中。观察人肺腺癌PC9细胞的生长状态，待细胞生长至80%～90%时，加1ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，待其镜下细胞形状变圆，用2ml含10%FBS的DMEM培养液终止消化，离心速率800rpm，离心5min，弃上清，取1ml含10%FBS的DMEM培养液，轻轻吹打细胞使其均匀，置培养瓶中培养，隔天传代。收集PC9细胞，加1ml 10%FBS的DMEM培养液，轻轻吹打细胞使其均匀，取10μl细胞悬液，贴着载玻片边缘注入细胞计数板，镜下计数，调整细胞个数为2×107/ml的单细胞悬液后，以0.1ml/只的量注射接种于裸鼠腋部皮下，行体内培养。

1.2.2 动物分组及给药：接种人肺腺癌PC9细胞后，将裸鼠称重、编号，随机分为模型对照组（模型组）、DT低、中、高剂量组（15、30、60mg/kg）和顺铂对照组（顺铂组）（1mg/kg），每组7只。造模7天后开始灌胃给药，连续4周。

1.2.3 一般体征观察：对实验小鼠每3天测1次体重，分组记录。观察并记录各组小鼠的精神、活动、毛发、饮食、大小便、皮肤（包括肛周）等一般情况，对实验期间死亡的小鼠进行解剖，大体观察并留取组织学标本。

1.2.4 样本制备：实验期末，各组小鼠禁食不禁水12h，称定体质量，游标卡尺测量瘤径；眼后静脉丛采血，4℃，3500r/min离心15min，分离血清，供炎症因子检测用；解剖小鼠，完整剥离瘤块，称重，计算抑瘤率。

1.2.5 血清炎症因子水平检测：取上述采集的血清样本，ELISA法检测各样本中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子水平，操作严格按照说明书进行。

1.2.6 肿瘤组织c-JUN、COX-2蛋白表达检测：采用免疫组化法。取上述经10%福尔马林固定的瘤组织，常规脱水，石蜡包埋，切片（4μm），免疫组化DAB显色法（脱蜡→水化→抗原修复→灭活内源性过氧化氢酶→5%BSA封闭→孵育抗c-JUN、COX-2一抗或PBS→孵育二抗→DAB显色→苏木素染核→脱水→二甲苯透明→封片→镜下观察）观察瘤组织中c-JUN、COX-2蛋白的表达，以细胞内有明显黄色/棕黄色颗粒判定为阳性细胞；采用image-pro plus5进行蛋白表达分析和统计。

1.3 统计学分析：采用SPSS 16.0统计学软件分析处理，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析多重比较，各数据均采用±s表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DT对荷瘤裸鼠体重及抑瘤率的影响：如表1结果显示，各组裸鼠体重无显著性差异（P＞0.05）；在抑瘤率上，顺铂和60mg/kg DT较为接近。

表1 各组体重及瘤重比较（±s，n=7）

表1 各组体重及瘤重比较（±s，n=7）

抑瘤率（%）-32.2-14.1-0.3 39.5分 组模型组顺铂组低剂量组中剂量组高剂量组剂量 (mg/kg）-1 1 5 30 60体重（g）25.8±2.3 22.9±2.1 25.4±2.0 25.4±2.2 24.8±1.4

2.2 DT对荷瘤裸鼠血清炎症因子及瘤组织c-JUN、COX-2表达的影响：由表2可见，30mg/kg DT能显著降低荷瘤模型动物血清TNF-a、IL-6水平。60、30mg/kg DT能显著抑制PC9肺癌移植瘤组织c-JUN和COX-2蛋白表达，改善肿瘤炎症微环境（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

表2 各组血清炎症因子水平比较（±s，n=7）

表2 各组血清炎症因子水平比较（±s，n=7）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

分组模型组顺铂组低剂量组中剂量组高剂量组IL-1β(pg/ml)14.4±1.2 14.0±1.8 17.0±2.2 13.4±1.0 13.7±2.7剂量（mg/kg）-1 1 5 30 60 TNF-α(pg/ml)87.7±18.9 34.7±2.1**75.1±15.0 52.7±14.6*82.9±28.0 IL-6(pg/ml)19.3±1.6 14.0±2.5**17.3±2.1 11.9±2.2**17.0±3.6

图1 各组肿瘤组织c-JUN、COX-2蛋白表达（400×）

3 讨论

已知炎症为恶性肿瘤的第八大生物学特征，IL-6等炎症细胞因子介导的炎症反应在肿瘤发生发展及侵袭过程中发挥了重要作用，靶向炎症细胞因子的抗肿瘤药物开发以及亚临床和临床研究已是目前肿瘤转化医学的一大热点[4]。中医学理论认为，肿瘤源于“正气亏虚，毒瘀互结”脉络而成，“癌毒”是肿瘤发生、发展的关键因素；“癌毒”病机理论与肿瘤炎性微环境密切相关，癌毒的形成过程及病机特点与肿瘤炎性微环境中“炎症-肿瘤”的转化过程具有相似性。现代研究表明，肺癌的发生发展与吸烟等刺激引起的肺局部持续炎症状态密切相关。香烟烟雾中含有的大量自由基可损伤肺泡上皮细胞，激活IKKβ/NF-κB、JNK通路，使IL-1β、IL-6等炎症因子大量分泌，促进组织局部的炎症反应，导致细胞过度增殖及细胞级联反应活化，引起DNA不可逆损伤，启动细胞向转移性疾病发展，促进了肺癌的发生。

研究结果表明，丹参二萜醌能显著降低荷瘤模型动物血清TNF-a、IL-6水平，抑制PC9肺癌移植瘤组织c-JUN和COX-2蛋白表达，抑制移植瘤生长。因此，丹参二萜醌能够祛瘀去毒，抑制炎症反应，改善肿瘤炎症微环境，拮抗肺癌的发生。