林 健 林志立 魏文珺 甘小翠

(莆田学院药学与医学技术学院 福建莆田 351100)

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，具有强大的形成生物被膜(biofilm，BF)的能力[1]。根据美国NIH统计，超过80%的人类感染性疾病是由细菌生物膜介导的[2]，例如金黄色葡萄球菌引起的导管相关感染[3]、下呼吸道流感嗜血杆菌生物被膜的形成与慢性阻塞性肺疾患急性发作相关性[4]等，在这些细菌中，金黄色葡萄球菌引起的感染仅次于大肠杆菌，由此可见其致病能力。近年来，随着医学界对某些环境中常见细菌所致的一些慢性和顽固性疾病的深入了解，发现以生物被膜形式存在的细菌不同于浮游细菌，它们对抗生素等杀菌剂、恶劣环境及宿主免疫防御机制有着很强的抗性。此外，其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒，为人类带来非常严重的公共卫生负担。

生物被膜是指细菌附着于生物或非生物的接触表面生长，分泌多糖、蛋白质等多聚物构成细胞外基质，将其自身包裹其中而形成的大量细菌聚合物[5]。从成熟的生物被膜模型可以看出，从外到内包括主体生物被膜层(bulk of biofilm)、连接层(linking film)、条件层(conditioning film)、基质层(substratum)[6]。它的形成是一个动态变化的过程，包括细菌起始粘附、BF发展和成熟等阶段[7]。细菌生物被膜的形成不仅受自身基因的调控，还受其菌团所处的外界环境如温度、时间、PH、载体、营养条件等影响。了解这些因素对生物被膜形成的影响，可为研究生物被膜的生理生化特征以及控制生物被膜的形成提供技术和理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

金黄色葡萄球菌(ATCC25923)购自中国食品药品检定研究所；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)(北京奥星生物技术有限公司)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)；结晶紫(天津市光复精细化工研究所)；96孔平底细胞培养板(上海生工生物工程有限送死)；酶标仪(日本Bio-Rad公司)；ZW-A微量振荡器(常州国华电器有限公司)；数显恒温振荡器(金坛市精达仪器制造有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的复苏 取冻干保存的金黄色葡萄球菌划线于普通琼脂平板，在37℃温箱中孵育24h，在挑取单个菌落接种于TSB中，37℃温箱中培养12-16h。

1.2.2 玻璃试管法 将培养过夜的菌液用TSB培养基稀释至麦氏比浊度为0.5，稀释至菌落数为106cfu/mL无菌条件下吸取20μL菌悬液接种于2mL液体TSB中，将试管于37℃恒温箱中分别培养1d、2d、3d、4d、5d，弃去培养液，用PBS漂洗3次，甲醇固定10min后，加入2.5mL 1%结晶紫室温下染色30min，吸取试管中多余的结晶紫染色液后，在自来水下冲洗试管3～5min，倒置试管除去水份，自然烘干。肉眼观察液面与空气接触处的玻璃试管壁。

1.2.3 结晶紫染色法半定量测定生物被膜形成量

(1)NaCl浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响。采用含不同浓度NaCl(0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)的TSB培养基230uL和106cfu/mL菌液20μL混合后在96孔培养板进行37℃，培养2d，平行实验3次。

(2)葡萄糖浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响。在96孔细胞培养板中加入含不同浓度的葡萄糖(0%、0.2%、0.5%、1%、2%、3%)的TSB培养基230μL和106cfu/mL菌液20μL混合后进行37℃培养2d，平行实验3次。

(3)不同培养基浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响。在96孔细胞培养板中分别加入含不同浓度的TSB溶液(5%、20%、100%)230uL，并接入20μL和106cfu/mL金黄色葡萄球菌菌液，37℃培养2d，以250μL无菌水的孔作为对照。

(4)生物被膜光密度值(OD值)和粘附程度的测量。培养结束后，弃去培养液，用PBS漂洗3次，然后用250μL的甲醇固定10min。弃去固定液，用250μL 1%的结晶紫染色30min，用自来水冲洗除去多余的结晶紫，晾干；再向每孔加250μL的95%的乙醇，振荡器上振摇10min以释放生物被膜中的结晶紫，测定其在595nm处的吸光值，平行实验3次。

2 结果

2.1 不同培养时间对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响

试管法不同培养时间对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响情况见图1。

图1 试管法不同培养时间对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响

由图1可知，随着培养时间的增加，试管玻璃壁上被染色部分增多，颜色加深，2d后形成的生物被膜明显，5d后最为明显。

2.2 Nacl浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响

NaCl浓度变化对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响见图2。

图2 NaCl浓度变化对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响

从图2可以看出，当氯化钠浓度越高时，金黄色葡萄球菌生物被膜的生长能力反而越低。

2.3 葡萄糖浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响

葡萄糖浓度变化变化对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响见图3。

图3 葡萄糖浓度变化对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响

由图3可见，当葡萄糖浓度>0.5%之后开始趋于平缓，说明葡萄糖对金光色葡萄球菌生物被膜生长具有促进作用，但这种促进作用是有限的。

2.4 不同培养基浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响

不同培养基浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜的影响见图4。

图4 不同培养基浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜的影响

图4表明，金黄色葡萄球菌生物被膜的OD值随着培养基浓度的升高而增大。说明富营养环境有利于金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。

3 讨论

众所周知，时间、营养条件、温度、盐浓度、糖分等多种因素均能影响金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。金黄色葡萄球菌生物被膜在一定的条件下，2d后即可以形成较为稳定的生物被膜。金黄色葡萄球菌在形成生物被膜的过程中，可对糖分进行利用，因此糖分和低浓度的氯化钠有利于金黄色葡萄球菌形成生物被膜，氯化钠对其促进作用是有限的，高浓度的氯化钠会抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的生长。因此，在临床感染性疾病诊疗过程中，为有效防止金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，应尽可能控制患者的血糖浓度，从而避免为金黄色葡萄球菌生物被膜生长提供温床。

随着经济的发展和民生的改善，食品、医疗安全已成为人们关注的重中之重，而给食品安全和公众健康带来巨大威胁和挑战的病源微生物更是人们关注的焦点。金黄色葡萄球菌形成生物被膜，使得对外界环境因素(杀菌消毒剂、高温高盐、强酸和抗生素等)刺激的抵抗性大大增强[8]，这为它产生免疫逃逸作用，寄居生存于医疗器械表面和机体粘膜提供了绝佳条件。文章通过在不同的条件下对金黄色葡萄球菌生物被膜的生长情况进行研究可得，金黄色葡萄球菌生物被膜的生长能力与培养条件有着十分密切的关系，培养时间、营养条件、糖分、氯化钠等均会对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成产生影响，这就为更好地控制金黄色葡萄球菌生物被膜的生长提供了依据。