丁玉梅谢俊俊张 杰姚春馨张兴国杨正安*

（1西南大学园艺园林学院，重庆 400715；2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南昆明650223；3云南省农业生物技术重点实验室，云南昆明 650223，4云南农业大学园林园艺学院，云南昆明650201）

黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia，2n=40）为葫芦科南瓜属的一年或多年生草本藤蔓性植物，因种皮呈黑色而得名。黑籽南瓜是喜温、不耐热的短日照作物，生长势强，叶片缺刻深裂、近圆形，叶形与无花果的叶很相似，又称为“无花果叶瓜”，又因其成熟后瓜瓤像米线或粉丝，在云南又称之为“米线瓜”或“粉丝瓜”。黑籽南瓜原产中美洲至南美洲高海拔地区，现在已分布于全世界各地，但适宜生长的地区范围小，仅在低纬、高海拔地区栽培，又因其食用价值不高，一般蔬菜工作者对黑籽南瓜不甚了解，也鲜有研究。随着我国蔬菜种质资源收集工作的开展，种质资源保存、评价和利用研究越来越受到重视，20世纪70年代末，我国首次组织专业科技人员，对重点地区的蔬菜种质资源进行实地考察，素有“植物王国”之称的云南是考察的首选地区，由中国农业科学院和云南省农业科学院组成的云南蔬菜品种资源考察组，发现了具有耐寒、抗病等多种优异性状的这一云南山区瓜类作物—黑籽南瓜（周立端和厉凤琴，1983；黄兴奇，2007）。随后，以黑籽南瓜为砧木的瓜类嫁接试验获得成功，黑籽南瓜资源的开发利用价值进一步提升（周立端 等，1994）。近年来，越来越多的研究者把黑籽南瓜作为研究对象，这得益于植物生理学、生物技术以及分子生物学等学科的飞速发展，也是基于黑籽南瓜所具有的多个优良性状以及所蕴含的抗逆基因资源。本文从黑籽南瓜栽培及利用概况、遗传多样性、抗逆性及其抗逆生理基础、细胞生物学及细胞工程、基因分离克隆等几个方面介绍黑籽南瓜的研究现状，以期为黑籽南瓜资源利用、瓜类栽培与育种、瓜类抗逆基因发掘提供参考，推动黑籽南瓜科研和产业的发展。

1 黑籽南瓜栽培与资源利用概况

1.1 黑籽南瓜栽培概况

黑籽南瓜在我国最早栽培于云南丽江地区，已有逾100 a历史，在四川和贵州等高海拔地区也有较长的栽培史（赖众民，1991；蔡克华，1994）。黑籽南瓜主要在山区种植，栽培管理较为粗放。一般于4月播种，可直播可育苗，至10月收获，也有以宿根越冬的无需播种的栽培方式，种植制度主要与玉米间作，极少单作。黑籽南瓜的一年生主蔓可达20 m，分枝性强，匍匐茎上能产生不定根，单株结瓜20～30个，果实为长圆形或近球形，单瓜质量2～5 kg，单株种子产量可达50～150 g，正常开花结果的条件为日照时数不超过13 h，夜间气温不超过15 ℃，从开花至种瓜成熟不小于90 d（蔡克华，1994；周立端 等，1994）。

云南为亚热带高原气候，尤其是海拔1 600～2 000 m的山区，四季温暖，夏无酷暑，冬无严寒，无霜期长达250～300 d，最适于黑籽南瓜生长（厉凤琴和周立端，1993）。在20世纪70年代末的蔬菜资源考察中即肯定了云南作为全国黑籽南瓜主产地的重要地位，同时确立了云南作为全国黑籽南瓜种子生产基地。紧接着，云南省农业科学院的科研人员在云南昆明、禄劝等地进行云南黑籽南瓜繁种，带动云南省楚雄州和红河州内20多个县市建成万亩繁种基地，销售种子产生的经济效益也使得黑籽南瓜栽培面积直线上升（周立端 等，1994）。据不完全统计，黑籽南瓜种子从20世纪80年代的年销售60 t，到十多年前的千余吨，到目前黑籽南瓜种子产量已达万余吨，平均售价 3. 0 万元·t-1，总产值达3. 2亿元（杨正安 等，2011），初期种子主要销往北方地区作为保护地瓜类栽培的嫁接砧木，近年来也销往黄河中下游的河南、河北、山东、天津、安徽等地，还出口日本和韩国用作黄瓜温室栽培的嫁接砧木（赖众民，1991）。由于近年来嫁接育苗用途和炒货用途对黑籽南瓜种子市场竞争的矛盾日益突出，使黑籽南瓜种子供不应求，在云南省更多地区推广黑籽南瓜的种植，是山区农民脱贫致富的一个特色产业。

1.2 黑籽南瓜作为瓜类嫁接砧木的利用

黑籽南瓜嫩瓜可炒食，但风味清淡，不受喜爱，因此多作饲料用，而种子营养价值极高，已开发炒货作为休闲食品。黑籽南瓜的主要利用价值是作为瓜类栽培的嫁接砧木，不仅具有耐土壤瘠薄、低温、干旱和耐盐等优异特性，而且对瓜类枯萎病和疫病等土传病害抗性强（翁祖信 等，1993；王汉荣 等，2005）。20世纪60年代日本等国已开始利用黑籽南瓜高抗土传病害的特性，用其作为砧木与黄瓜、西瓜嫁接，亲和性好，嫁接苗根系耐低温（周立端 等，1994；Lee et al.，1999）。之后，黑籽南瓜种子用量持续上升，主要利用其高抗枯萎病的特性用作嫁接砧木防治瓜类枯萎病（周立端等，1994；曾义安 等，2004；冯春梅 等，2006；李红丽 等，2006；吕桂云 等，2010；乔燕春 等，2013；梁祖珍 等，2014），给瓜类生产带来了巨大的经济效益。多位研究者还报道了黑籽南瓜作为砧木对瓜类作物产量和品质具有提升和改善作用（冯春梅 等，2006；李红丽 等，2006；朱进 等，2006 a；王铁臣 等，2010；董邵云 等，2013；梁祖珍 等，2014；陈银根和吕文君，2017；陶美奇 等，2018），主要表现在与自根黄瓜相比，能提高黄瓜植株生长速度、结实率和产量，食味品质得到改善（口感香甜和微甜），还可提高黄瓜果实VC以及Ca、Mg、Fe等矿质营养含量；但嫁接黄瓜果实蜡粉率保持在90%，增加了果实表面蜡粉量，是黑籽南瓜在嫁接方面用量急剧减少的主要原因。王文娇等（2017）研究表明，黄瓜5个蜡质合成相关 基 因 CsCER1、CsCER3、CsCER6、CsCER8和CsCER10在黑籽南瓜嫁接植株中的表达量明显高于白籽南瓜嫁接苗和自根苗，由此推测这5个基因与黑籽南瓜嫁接导致的蜡粉含量增加密切相关。王慧（2015）研究了砧木影响嫁接黄瓜果面蜡粉形成的机制以及与外源硅的关系，发现在水培营养液中添加1.7 mmol·L-1的K2SiO3后，脱蜡粉能力弱的云南黑籽南瓜嫁接黄瓜苗根系中的硅转运蛋白基因CmLsi1、CmLsi2-1、CmLsi2-2和CmLsi3 的表达量均低于脱蜡粉能力强的中国南瓜砧木黄诚根2号嫁接黄瓜苗中的表达量。赵升（2018）也研究发现黄瓜果皮硅转运蛋白基因CsLSi1、CsLSi6和CsLSi2表达受嫁接砧木的影响，在黑籽南瓜砧木嫁接苗中表达量较高，而在黄诚根2号砧木嫁接苗中表达量则较低。近年来，已开发和培育出多种瓜类嫁接的砧木，如葫芦、中国南瓜、瓠瓜、棘瓜等（顾兴芳 等，2006；张圣平 等，2006；张红梅 等，2007；李欣等，2011a；张凡 等，2011；王永成 等，2013；曹齐卫 等，2016；陶美奇 等，2018），但以黑籽南瓜作为砧木的嫁接苗在抗病性、耐冷和耐盐能力等方面仍优于其他砧木（冯春梅 等，2006；蔡雁平 等，2008；梁祖珍 等，2014），综合表现较好。近年来黑籽南瓜种子用量供不应求，在云南的栽培也逐渐从野生、半野生状态转变为人工栽培，由于不注意提纯复壮，致使黑籽南瓜种性退化，降低或失去原有的抗性（李耀光 等，2007）。笔者认为，首先，应该对现有砧用黑籽南瓜品种进行提纯复壮，这需要育种工作者的长期参与；其次，应对现有黑籽南瓜种质资源的抗性（特别是枯萎病抗性）进行系统鉴定和评价，筛选抗性或耐性更强的种质资源加以利用显得尤为重要且迫切。

1.3 黑籽南瓜远缘杂交利用

长期优质、高产的育种目标使得瓜类作物一些优良抗逆基因在人工驯化和定向选择过程中丧失，造成栽培瓜类遗传背景狭窄，而黑籽南瓜具有抗多种生物或非生物逆境的遗传性状，将黑籽南瓜和栽培瓜类进行种间甚至属间远缘杂交，促进黑籽南瓜有利抗逆性状向栽培瓜类的转移，可以创造瓜类育种新种质，达到改良栽培瓜类作物的目的。但目前，仅有马海龙等（2011）报道了黑籽南瓜与南瓜属其他栽培种之间的远缘杂交研究，以美洲南瓜、中国南瓜、印度南瓜3个种共12个材料为母本，以黑籽南瓜为父本进行种间杂交研究，仅获得了18株中国南瓜×黑籽南瓜F1植株。中国南瓜×黑籽南瓜F1形态为双亲中间型偏父本，其抗病性（枯萎病、病毒病和白粉病）、抗虫性（粉虱和蚜虫）倾向于母本中国南瓜，推测黑籽南瓜抗病、抗逆性状的跨种遗传可能由隐性单基因、隐性寡基因或由数量性状多基因控制。该研究中由于F1植株具有的杂种不稔性，未得到回交后代，相关研究未见后续报道，如能获得黑籽南瓜与南瓜属其他栽培种之间可育的种间杂交后代，则可促进南瓜属作物的抗性遗传、抗性生理、抗性基因分离的研究和南瓜属作物抗性新品种的选育。为了获得可育的远缘杂交后代，可进一步扩大参与杂交的亲本材料试配，结合染色体加倍及胚挽救培养等细胞工程技术克服杂交后代的不育问题。

2 黑籽南瓜遗传多样性

黑籽南瓜在我国云南、四川、贵州等海拔较高的地区有较长的栽培历史，由于这些地区经济欠发达，交通不便，以及自然地理环境的多样性，形成了黑籽南瓜丰富的地方品种资源。从种子籽粒大小可将黑籽南瓜分为大粒、中粒和小粒3种类型（邓朝鲜 等，1994；龙荣华 等，2013），根据果实成熟时的花纹可将其分为白皮、花皮和绿皮3种类型（杨正安 等，2011；成晓静 等，2015）。利用分子标记技术对黑籽南瓜资源进行遗传多样性分析可为引种栽培和品种改良提供参考。刘小俊等（2005）对来源于四川、云南的10份黑籽南瓜资源进行RAPD标记分析表明，我国现有栽培黑籽南瓜种质资源的遗传变异度较小，多样性水平较低，与杨正安等（2011）和成晓静等（2015）以云南黑籽南瓜为材料的研究结论有差别。成晓静等（2015）采用RAPD标记对云南白皮、花皮和绿皮3种类型黑籽南瓜亲缘关系分析表明，绿皮类型与白皮、花皮类型间的亲缘关系较远（平均遗传距离为0.94），而白皮类型与花皮类型间的亲缘关系较近（平均遗传距离为0.40）。杨正安等（2011）采用RAPD和ISSR标记技术对来源于云南省6个地州13份黑籽南瓜种质进行遗传多样性分析，RAPD和ISSR标记检测供试材料的遗传相似性系数范围分别为0.340～0.895和 0.162～0.941，ISSR检测多态性效果高于RAPD，RAPD标记聚类分析将供试种质分为3个类群5组，ISSR标记聚类分析将供试种质分为4个类群6组。来源于云南建水县官厅镇的黑籽南瓜与来源于青龙乡、普雄镇的亲缘关系较远，形成独立的类型，处于最基础的地位，而该地区出产的黑籽南瓜品质最优（发芽率高、发芽势强），该研究表明地域上的不同不是造成黑籽南瓜材料间亲缘关系远近的原因。

3 黑籽南瓜抗逆性及其生理基础

黑籽南瓜由于长期处于野生、半野生状态，为适应不良的自然环境，对低温、干旱、高盐、土壤瘠薄、病虫害等形成了较强的抗性或耐性。黑籽南瓜作为瓜类嫁接的砧木主要也是因其具有的抗逆性（主要抗枯萎病），许多研究报道了黑籽南瓜受到不良环境因子胁迫后对生长的影响及其生理响应机制，包括以黑籽南瓜为砧木嫁接后接穗瓜类抗逆性提高的生理机制。

3.1 耐高温或低温

在瓜类作物栽培中，夏秋栽培特别是在棚室栽培中，地温常超过30 ℃，形成高温逆境，对瓜类生产极为不利。郝婷等（2014a）以黑籽南瓜、黄瓜、苦瓜和2个丝瓜品种为材料，35 ℃根际高温胁迫使得黑籽南瓜和黄瓜株高、茎粗、叶面积等植物学性状及叶绿素相对含量（SPAD）、叶片净光合速率（Pn）等与光合效率有关的参数受到显著抑制；高温导致黑籽南瓜和黄瓜根系中MDA积累，脯氨酸和可溶性蛋白含量减少（郝婷 等，2014b）；5种瓜类作物对根际高温的耐受性有明显差异，黑籽南瓜和黄瓜对根际高温的耐性较差。张红梅等（2016）研究了高温条件下不同砧木嫁接黄瓜苗的生长量和光合特性，表明以白籽南瓜和丝瓜为砧木的嫁接苗对高温胁迫的耐性比黑籽南瓜和冬瓜嫁接苗强。李思思等（2017，2018）也报道，以五叶香丝瓜为嫁接砧木的黄瓜植株耐热性强于黑籽南瓜嫁接植株。综上所述，黑籽南瓜抵御高温能力较差，这一结论与黑籽南瓜长期在高海拔山区栽培，喜温但不耐热的特性相符。

有关黑籽南瓜抗极端温度逆境多数报道集中在抗寒性方面。于贤昌等（1998）报道黑籽南瓜抗冷性优于日本的南瓜种间杂交种新土佐。乔永旭等（2014）比较了12 ℃亚低温胁迫下黑籽南瓜和黄瓜水分代谢和光合特性的应答差异，表明黑籽南瓜抵御亚低温胁迫的能力明显强于黄瓜。15 ℃低温胁迫下黑籽南瓜根系边缘细胞（RBC）数目和黏胶层厚度的增加程度高于黄瓜，活性降幅和凋亡率则明显低于黄瓜，表明黑籽南瓜抵御低温胁迫的能力强于黄瓜（乔永旭，2015）。

以黑籽南瓜为砧木可提高嫁接瓜类对低温胁迫的耐受性。于贤昌等（1998）研究表明，黑籽南瓜嫁接黄瓜苗的抗冷性显著增强，表现在5 ℃低温胁迫下幼苗冷害指数变小，电解质渗漏率下降，胁迫后光合功能恢复较快等。陈贵林等（2000）研究表明，以黑籽南瓜为砧木的西瓜嫁接苗在5 ℃低温胁迫下，其光合速率、叶绿素含量和可溶性蛋白含量均显著高于自根苗。季俊杰等（2007）报道了低温胁迫下黑籽南瓜嫁接黄瓜植株的蔗糖、葡萄糖、可溶性蛋白含量和叶片羧化率高于自根黄瓜；李涛和于贤昌（2007）研究表明，低温胁迫下黑籽南瓜嫁接黄瓜植株吸收Mn、Cu和Zn的能力较强是其SOD活性显著高于自根黄瓜的重要原因之一 。高俊杰等（2009）则探讨了以黑籽南瓜为砧木嫁接增强黄瓜抗冷性的分子机制，认为嫁接苗叶片脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）维持较高的转录水平，较高的DHAR和GR活性是抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量明显高于自根苗的重要原因。许晓昀（2018）研究表明，在偏低温（18 ℃/12 ℃）和临界低温（10 ℃/5℃）逆境下，黑籽南瓜嫁接黄瓜叶片中的脱落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）、玉米素（ZR）含量显著高于自根苗。

有关不同砧木嫁接瓜类后的耐冷性研究表明，黑籽南瓜砧木嫁接苗耐冷性强于其他砧木嫁接苗。于贤昌等（1998）认为黄瓜嫁接苗的抗冷性与其砧木种类及接穗品种双方的耐冷性密切相关，并报道了黑籽南瓜嫁接苗的耐冷性强于南瓜杂交种新土佐嫁接苗。李欣等（2011b）研究表明，黑籽南瓜嫁接黄瓜苗的抗寒性强于白籽南瓜嫁接苗，可在低温胁迫下保持较高的POD、SOD和CAT活性及较低含量的MDA，与孙世君等（2017）的研究结果一致。孙世君等（2017，2018）的研究还表明，低温胁迫下黑籽南瓜嫁接黄瓜苗的15N吸收分配和利用能力均优于白籽南瓜嫁接苗和自根苗，嫁接苗的碳氮代谢相关酶活性均高于白籽南瓜嫁接苗和自根苗，且可溶性蛋白和脯氨酸含量最高。以黑籽南瓜为砧木的西瓜嫁接苗在7.5 ℃低温胁迫下，植株叶片净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度等光合特性指标及碳同化能力高于葫芦砧木嫁接苗和自根苗，黑籽南瓜砧木嫁接苗耐冷性强于葫芦砧木嫁接苗（刘慧英 等，2007）。

总之，黑籽南瓜及其嫁接苗的生长和生理代谢虽然受到低温胁迫的影响，但其抗寒性和耐低温能力仍然是瓜类作物中最强的，这也是在瓜类早春或日光温室生产中黑籽南瓜长期作为嫁接砧木的原因之一。

3.2 耐盐性

在蔬菜设施栽培中，土壤次生盐渍化问题日益突出，严重影响了作物生长发育，产量和品质下降，已成为当前设施栽培中的主要限制因子。许多学者研究了黑籽南瓜及其嫁接苗的耐盐性，并报道了其在盐胁迫下的生理响应机制，其中研究较多的是中性盐NaCl胁迫，对碱性盐和酸性盐胁迫也有少量研究。

不同学者比较了黑籽南瓜和其他瓜类种质之间的耐盐性差异，研究结论各有异同。朱进等（2006b）对不同砧木苗期的耐盐性鉴定结果表明，瓠瓜类的耐盐能力强于黑籽南瓜，其次是中国南瓜杂交种，西葫芦最不耐盐。周俊国等（2007）报道了中国南瓜杂交种成株期耐盐性强于黑籽南瓜，2种砧木耐盐性差异的主要原因是NaCl胁迫下Na+在各个器官积累量的差异，导致地上部各器官有不同的K+、Ca2+、Mg2+离子吸收和积累特性，从而造成中国南瓜杂交种生长抑制程度小于黑籽南瓜，且黑籽南瓜成株期Na+主要集中在茎部（周俊国 等，2008a），与王冉等（2006）在黑籽南瓜幼苗期受盐胁迫后Na+分布在根部的结论不同。NaCl胁迫使黑籽南瓜的活性氧产生速率和 H2O2含量高于中国南瓜杂交种，而中国南瓜杂交种根系中腐胺与精胺的比值较低，亚精胺和精胺总量与腐胺的比值则较高，多胺的含量也较高，植株清除活性氧的能力较强，其耐盐性优于黑籽南瓜（周俊国 等，2008b）。朱进和别之龙（2007）研究发现，盐胁迫下黑籽南瓜、超级拳王南瓜、超丰8848瓠瓜3种砧木幼苗光合特性无明显差异；但后续研究表明，低盐胁迫下 Na+主要集中在根茎部，高盐胁迫下Na+主要集中在茎部，通过根茎阻止Na+向叶片运输，是超丰8848瓠瓜和黑籽南瓜2个砧木耐盐的主要生理机制（朱进和别之龙，2008）。朱进和别之龙（2008）认为，黑籽南瓜耐盐性强是由于其在盐胁迫下具有更高的根系活力，而周俊国等（2008b）则认为K+/Na+降低幅度不同是造成砧木耐盐性差异的原因之一。 王丽萍等（2011）的研究表明，酸性盐Ca（NO3）2胁迫对砧木生长的抑制作用小于中性盐NaCl胁迫，白籽南瓜具有高效清除体内活性氧能力是其耐盐性高于黑籽南瓜的重要原因。孙涌栋等（2014）则报道了外施NaHS可有效缓解碱性盐NaHCO3胁迫对黑籽南瓜种子萌发的抑制作用，与郝园园和江雪飞（2015）的研究结果一致。

以黑籽南瓜为砧木的嫁接瓜类的耐盐性研究多集中在嫁接黄瓜上，研究表明嫁接栽培能显著提高黄瓜的耐盐能力（袁祖华和蔡雁平，2007；黄远，2010）。对嫁接黄瓜苗耐盐性增加的生理机制研究表明，在NaCl胁迫下，嫁接黄瓜苗中脯氨酸和可溶性糖含量均明显高于自根苗，活性氧产生速率和MDA含量低于自根苗（袁祖华和蔡雁平，2007）；黄远（2010）的研究也表明，嫁接黄瓜能够维持较高的锰和总微量元素含量，较高的SOD、POD和CAT活性，较低的电解质渗漏率和MDA含量。朱进等（2008）也认为，具有更好的渗透调节和抗氧化能力是超丰8848瓠瓜嫁接黄瓜苗耐盐性高于黑籽南瓜嫁接苗的重要生理原因，与云南黑籽南瓜嫁接黄瓜苗耐盐性优于南夏尔巴、新土佐和铁力砧3种中国南瓜砧木嫁接苗的生理机制相似，且黑籽南瓜嫁接苗 Na+/K+最低（田雪梅 等，2012）。周俊国和扈惠灵（2010）研究了黄瓜嫁接苗叶片的氮素代谢，结果表明NaCl胁迫下中国南瓜杂交种嫁接黄瓜苗氮素代谢能力下降幅度比黑籽南瓜嫁接苗小，不同砧木嫁接氮素代谢能力的差异在于根系吸收氮源能力的差异，也造成了耐盐能力的差异。

由此看来，黑籽南瓜具有较强的耐盐性，但弱于某些瓜类作物如瓠瓜，而瓜类嫁接苗的耐盐性取决于所使用的砧木（蔡雁平 等，2008；朱进 等，2008；周俊国和扈惠灵，2010；田雪梅 等，2012）。

3.3 耐连作和低营养

瓜类是设施栽培中的一类主要蔬菜，因常年连作或复种指数高而产生严重的连作障碍，许多研究者认为根系分泌的自毒物质（如肉桂酸）是连作障碍的主要原因。近年来的报道表明黑籽南瓜具有耐肉桂酸（CA）和低营养胁迫的能力，这是黑籽南瓜作为瓜类嫁接砧木的又一优势。乔永旭等（2014）研究了CA胁迫下黄瓜和黑籽南瓜的水分代谢与光合代谢差异，结果表明CA胁迫降低了2种瓜类作物的净光合速率和蒸腾速率等，增加了水分利用效率和地上部干物质的分配比例，但黄瓜受到的胁迫程度明显高于黑籽南瓜。随后，乔永旭等（2015）研究发现黑籽南瓜根系边缘细胞（RBC）因具有较高的活力、较低的凋亡率及较厚的黏胶层等特性，其抵御CA胁迫的能力强于黄瓜。黑籽南瓜的RBC防御CA对自身根系毒害的能力明显强于黄瓜，表现在CA 胁迫对根尖附着有RBC的黑籽南瓜根系活力、活性氧和MDA 含量、抗氧化酶活性以及抗氰呼吸速率的影响均不显著，但对黄瓜影响显著（乔永旭 等，2015）。最近，张永平（2018）报道硝普钠（SNP）可以缓解CA对黄瓜和黑籽南瓜的胁迫，SNP能提高 CA处理下黑籽南瓜RBC数目与存活率，SNP对黑籽南瓜的缓解作用小于黄瓜。

有关黑籽南瓜耐低营养胁迫的研究较少。曹丽霞等（2009）研究表明，缺磷胁迫后黑籽南瓜幼苗地上部生物量显著降低，根冠比增大；根系吸磷量和磷转运率下降，根系磷利用效率显著增加。总根长和根表面积增加可能与其磷吸收效率增加密切相关，是黑籽南瓜幼苗对缺磷胁迫的适应性变化，也是黑籽南瓜耐缺磷胁迫的原因；另外还发现缺磷胁迫后根系分泌物中多了一些特有的酚类和酯类。缺磷胁迫的黑籽南瓜根系分泌物对黑籽南瓜胚根和胚轴的化感抑制作用明显增强。杨明挚等（2004）研究了黑籽南瓜对低氮环境的耐受性，表明在低氮环境下黑籽南瓜的根系活力、硝酸还原酶活性、氨基酸含量、生物量、叶绿体含量都明显高于中国南瓜。尹梅等（2003）研究表明，黑籽南瓜抗逆性、抗旱性比中国南瓜强可能与其叶片中游离脯氨酸和钙元素含量高有关。

3.4 耐其他非生物逆境

近年来随着环境污染的加重，酸性土壤面积所占比例越来越高，Al3+是酸性土壤中限制作物生长和矿质元素吸收而导致减产的一个主要胁迫因子。周楠等（2006）研究发现，Al3+可明显抑制黄瓜根系的生长，延缓黄瓜植株生长发育，从而导致黄瓜产量降低。乔永旭（2016）研究了黄瓜和黑籽南瓜对于Al3+胁迫的应答差异，2种瓜类作物的根长、根鲜质量、RBC数目、活率均随着Al3+浓度的增大而降低，但黄瓜的下降幅度较黑籽南瓜明显；黑籽南瓜抵御Al3+毒害的能力优于黄瓜。张自坤等（2010）研究发现，Cu2+胁迫下黑籽南瓜嫁接黄瓜幼苗根系中多胺（结合态腐胺、亚精胺和精胺）的合成比自根苗增加，其降解相关酶二胺氧化酶和多胺氧化酶活性显著低于自根苗，使嫁接苗多胺含量维持在较高水平，由此提高了黄瓜嫁接苗耐Cu2+胁迫的能力。高宇等（2017）报道，增加CO2浓度可以促进白籽南瓜和黑籽南瓜嫁接黄瓜苗生长，但黑籽南瓜嫁接苗形态指标、叶绿素 SPAD 值和净光合速率明显优于白籽南瓜嫁接苗。

有关黑籽南瓜对其他非生物逆境（如重金属和有害气体）的抗性或耐性的研究未见报道，随着城市化进程的加快和新型环境污染的日益严重，筛选鉴定对这类逆境有较强抗性或耐性的瓜类种质资源也是今后研究的方向之一。

3.5 抗生物逆境

植物在抗生物逆境过程中，体内的生理生化代谢、细胞和组织结构以及分子水平都发生了一系列复杂的变化（Koornneef & Pieterse，2008；Bari &Jones，2009），植物应答生物逆境胁迫的分子机制至今未完全阐明。

3.5.1 枯萎病抗性 自20世纪90年代以来，利用黑籽南瓜为砧木防治瓜类枯萎病，已成为解决瓜类生产中枯萎病危害的主要农业措施（周立端 等，1994；曾义安 等，2004；梁祖珍 等，2014；王卿和林玲，2016）。研究发现，不同类型的黑籽南瓜抗枯萎病能力存在差异，绿皮和花皮类型黑籽南瓜对枯萎病的抗性强于白皮黑籽南瓜（杨正安 等，2017），这3种类型黑籽南瓜对枯萎病菌侵染后的光合特性和生理响应亦不同，枯萎病菌侵染后，抗性弱的白皮黑籽南瓜气体交换参数降幅最大，其光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（NPQ）也显著下降，POD活性和MDA含量则升高，SOD活性在抗性最强的绿皮黑籽南瓜中下降，在花皮黑籽南瓜中则表现增加。有研究发现，黑籽南瓜根系分泌物能明显抑制黄瓜枯萎病菌菌落的生长（黄奔立 等，2007）。乜兰春等（2007）也研究发现，在黑籽南瓜和西瓜根系分泌物中提取的有机酸，可以有效抑制西瓜枯萎病菌，且黑籽南瓜根系分泌物对枯萎病菌的抑制作用强于西瓜。

要阐明黑籽南瓜受枯萎病菌胁迫的响应机制，需对更多的生理生化代谢途径进行研究（如活性氧含量及类型），也需从枯萎病菌致病机制入手研究其释放的分子信号，黑籽南瓜抗枯萎病的信号传导途径和调节机制，抗病蛋白的表达和功能作用模式等也需要深入研究。

3.5.2 其他抗病虫特性 尽管黑籽南瓜可以有效控制瓜类枯萎病的发生与危害，但随着黑籽南瓜种子市场的需求量不断增加，大量的精细化和规模化栽培黑籽南瓜，不注意品种提纯复壮，致使一些种子混杂退化，降低或者丧失了原有抗性。1996年在兰州日光温室中黑籽南瓜嫁接黄瓜植株发生疫霉病（孙颉，1998），2007年山西日光温室中嫁接黄瓜苗有10%～15%的萎蔫死苗率，是因为黑籽南瓜砧木幼苗感染枯萎病所致（李耀光 等，2007）。白滨等（2013）也报道了甘肃日光温室内黑籽南瓜为砧木的嫁接西瓜苗发生了严重的根腐和颈腐病。

顾兴芳等（2006）评价了108份黄瓜砧木资源的抗南方根结线虫特性，其中黑籽南瓜表现为易感南方根结线虫。金国良等（2009）研究表明，南方根结线虫侵染显著降低了黑籽南瓜地上部生长速率，POD、SOD和多酚氧化酶（PPO）活性在侵染前期显著升高，而后下降；苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酪氨酸解氨酶（TAL）活性在接种侵染后比未接种对照增加，根结线虫的侵染使得黑籽南瓜抗氧化相关酶活性升高，以抑制活性氧的产生或提高木质素含量。

4 细胞生物学及细胞工程

1991年李友勇等利用细胞显微方法对南瓜属的黑籽南瓜、中国南瓜和印度南瓜进行了细胞学观察，表明黑籽南瓜染色体2n=40，同时发现黑籽南瓜染色体异染色质化在减数分裂末期I、间期和末期II，子细胞中常出现2～8个近圆形的染色很深的颗粒，它们呈有规律地分离（李友勇 等，1991）。黑籽南瓜的这些细胞学现象，使它既区别于其他物种，又区别于它的2个近缘种中国南瓜和印度南瓜。

开展黑籽南瓜的细胞工程研究，可以解决黑籽南瓜单株之间对低温和病害的耐受能力存在差异的问题，还可在此基础上进行遗传转化。郭德章等（2004）利用不同电场条件对黄瓜与黑籽南瓜子叶原生质体进行了对称融合，融合产物经液体浅层培养诱导出大量愈伤组织。关于黑籽南瓜离体培养再生体系的研究中，刘栓桃等（2004）采用下胚轴和子叶作为外植株均能再生不定芽，不定芽增殖培养基为：MS+6-BA 1.0 mg·L-1。徐恒戬（2006，2007）则研究发现不同外植体植株再生能力差异明显，通过添加6-BA和NAA，KT和NAA的外源激素组合，子叶加胚轴的部分能分化出再生植株。霍雨猛（2008）为了通过遗传转化使黑籽南瓜获得抗根结线虫的特性，在MS基本培养基中分别添加BA（2.0 mg·L-1）、TDZ（1.0 mg·L-1） 和 ZT（2.0 mg·L-1）等外源激素，建立了黑籽南瓜植株高频再生体系，并利用黑籽南瓜成熟胚为外植体，成功建立了黑籽南瓜成熟胚再生体系。

5 基因克隆

植物在受到外界逆境刺激后，通过系列信号分子调节相关抗逆基因和蛋白的表达，进而改变自身表观形态和生理生化水平来适应逆境（Ausubel，2005；Bari & Jones，2009）。因此，挖掘黑籽南瓜重要的抗逆基因或蛋白对解析黑籽南瓜抗逆的分子机理和进一步培育瓜类抗逆新品种具有重要意义。

杨明挚等（1999）利用RT-PCR技术分离了黑籽南瓜甘油-3-磷酸转酰酶（GPAT）基因，序列分析表明黑籽南瓜GPAT基因的cDNA及氨基酸序列与中国南瓜（Cucurbita moschata）相比分别具有98%和96.5%的同源性，黑籽南瓜与豌豆、红花、拟南芥和菠菜等抗冷性强的GPAT基因氨基酸序列对比发现，某些位点上的氨基酸残基完全相同，这些位点的相同氨基酸残基可能与GPAT 对底物酰基的选择性有关（杨明挚 等，2000）。此后，依据所克隆的植物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因中的保守氨基酸序列合成相应的简并引物，从黑籽南瓜基因组中克隆到了一些STK类的R-片段，可能来源于黑籽南瓜中某个抗病或抗病相关基因（杨明挚 等，2005）。杨正安等（2012）利用可转化人工染色体（TAC）为载体，构建了高质量的黑籽南瓜基因组TAC文库，为黑籽南瓜抗逆和抗病基因克隆奠定了基础。最近，丁玉梅等（2018）从黑籽南瓜基因组中克隆了抗病基因同源序列HQRGA2，属于典型的NBS-LRR类抗病基因，它与中国南瓜的NBS类抗病蛋白基因SQRGA-8和SQRGA-13的核苷酸相似性分别达到97.0%和98.0%，与中国南瓜抗病蛋白基因SQRGA-13氨基酸同源性达到96.6%，该研究还表明黑籽南瓜HQRGA2片段的表达受尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的胁迫诱导，可能为枯萎病抗性相关的基因片段。

6 研究展望

6.1 加强黑籽南瓜种质资源的收集、鉴定和利用

我国栽培的南瓜属作物主要有中国南瓜（Cucurbita moschata）、美洲南瓜（C. pepo）、印度南瓜（C. maxima）和黑籽南瓜（C. ficifolia）4个种，而黑籽南瓜在南瓜属4个栽培种中最接近野生种，综合抗性也最强。黑籽南瓜长期处于野生、半野生栽培环境，且多在高海拔冷凉山区栽培，长期以来并无精细规范的管理方法，为抵御不良自然生境和适应不良栽培环境，形成并保留着大量的优良抗逆性状，特别是对非生物逆境的抗性或耐性以及对病虫害的抗性等，而瓜类作物由于长期的人工驯化往往丧失抗性。黑籽南瓜所蕴含的优良抗性是进行瓜类遗传改良特别是抗病和抗逆性育种的重要遗传资源，但国内科研机构与育种单位对黑籽南瓜资源的收集和鉴定工作的重视度不够，处于较分散的状态，对一些优异性状，如抗虫性、耐低氮低钾等的鉴定评价未开展或不规范。20世纪70年代末中国农业科学院组织的蔬菜品种资源考察组曾对黑籽南瓜资源进行系统的考察和收集（周立端 等，1994），但未保存入国家种质库，收集资源份数不详。此后，有科研机构对黑籽南瓜种质资源进行零星的收集和保存，进行了遗传多样性的研究（刘小俊 等，2005；杨正安 等，2011；龙荣华 等，2013；成晓静 等，2015），但未开展系统的收集和保存工作，这与黑籽南瓜在瓜类生产中作为抗逆砧木产生较大经济效益和社会效益的地位不相符，黑籽南瓜的收集、研究刻不容缓。笔者认为，可以从以下几个方面加强对黑籽南瓜资源的鉴定和利用。第一，广泛收集不同自然地理生态条件下和不同栽培条件下的黑籽南瓜种质或地方品种，并对其进行系统的抗性或耐性鉴定和评价。此外，建立科学、规范的鉴定评价方法，形成针对某一性状的标准化评价规程尤为重要，特别是针对目前瓜类生产上急需改良或瓜类抗源缺乏的性状，如抗枯萎病、耐冷性和耐连作等，筛选出抗性或耐性更强的材料作砧木种质；对黑籽南瓜未报道的一些性状（抗虫性、抗霜霉病或病毒病）也需要进行评价研究，作为瓜类栽培利用和新品种培育的遗传资源储备。第二，对现有砧用黑籽南瓜种源地的品种进行提纯复壮（如云南建水、石屏等地区），以应对规模化栽培后种性或抗性丢失，选育出适应种源地栽培的砧用品种，规范并商业化用种市场，逐渐改变农户自留种和散乱经营的状态。第三，促进黑籽南瓜有利抗逆性状向栽培瓜类的转移，除利用传统的远缘杂交手段外，通过现代生物技术如胚培养、染色体加倍、花粉培养等技术可以克服不亲和性、不稔性和后代疯狂分离等，加快黑籽南瓜的远缘杂交育种进程。

6.2 加强嫁接基础理论研究

黑籽南瓜嫁接黄瓜是嫁接技术基础理论研究的理想模式和材料。许庆（2016）为了探明嫁接亲和性的分子机制，选用亲和性好的黑籽南瓜和亲和性差的中国南瓜东洋神力为砧木，以津春4号为接穗，通过转录组学和蛋白组学分析，发现亲和相关的特异基因差异表达分别参与了蛋白质代谢、运输、转录调控、氧化还原、防御应答和信号传导等过程。其中，亲和嫁接组合通过增加碳水化合物代谢及细胞壁相关的差异表达基因的表达来增强细胞增殖能力；不亲和组合通过增加氧化还原和胁迫应答相关的转录因子和激酶差异表达基因的表达，从而响应由嫁接不亲和导致的胁迫。要阐明嫁接亲和性的机理，还需从砧木和接穗之间的分子信号传导和信号蛋白的作用模式、功能入手。

6.3 加快黑籽南瓜基因克隆和抗逆机制研究

目前，对于黑籽南瓜的研究大多集中在抗逆性状的鉴定、逆境生理机制，以及作为砧木嫁接后瓜类生长发育、生理生化代谢等研究上，仅克隆到极少的与抗冷性和抗病性相关的基因或同源序列（杨明挚 等，1999，2000，2005；丁玉梅 等，2018），且未进行功能验证。由于对黑籽南瓜遗传背景的研究报道较少，尽管其抗性基因资源丰富，利用传统技术很难开展基因克隆研究。中国南瓜和印度南瓜（Sun et al.，2017）、黄瓜（Huang et al.，2009）、甜瓜（Garcia-Mas et al.，2012）和西瓜（Guo et al.，2013）基因组测序的完成，为黑籽南瓜的研究提供了便利，可以利用瓜类基因组数据库中所提供的NBS类基因的CDS序列及氨基酸进行比较和分类，从而设计出高度同源甚至特异的基因引物，便利地从黑籽南瓜中扩增不同类型的RGAs，为全长基因家族的获得奠定基础。另外，可以利用转录组学和蛋白组学技术研究抗感材料与病原菌互作后的基因表达谱和蛋白质谱表达差异，比较发现与病原识别相关的防御基因和防御机制。利用蛋白质组学技术快速挖掘出黑籽南瓜不同的抗性应答蛋白，通过克隆相关基因的方法获得新基因，然后借助成熟的瓜类遗传转化体系验证功能，对于解析黑籽南瓜抗逆性的分子机制和创制抗逆新种质都具有重要意义。

黑籽南瓜受到逆境胁迫后，要阐明黑籽南瓜抗逆机制还应从细胞生物学机制、激素代谢途径、信号传导和调控网络及生理生化途径等多角度、多方位入手，需要细胞生物学、植物生理学和病理学、分子生物学等多学科技术的综合应用。随着分子生物学技术的发展，分离克隆黑籽南瓜优异抗逆基因用于瓜类种质创新和抗逆机制研究将越来越受到重视，这对于瓜类栽培和育种的农业生产实践具有重要的实际意义。