赵圆圆 许晨新 张杰

摘要：基于粉末与横切面显微方法鉴别中药材威灵仙的3种基原，完善威灵仙药材的显微鉴别方法。对市场上采购的14批威灵仙药材分别采用横切面和粉末制片，考察并优化制片方法，观察比较不同批次药材的显微特征。结果表明，横切面的外皮层细胞排布、韧皮部、木质部显微特征显著，粉末的木纤维、韧皮纤维、石细胞、导管、非腺毛、木栓细胞、表皮细胞、皮层细胞显微特征显著。结合《中华人民共和国药典》标准，可根据横切面的外皮层细胞延长方向鉴别威灵仙;根据粉末的石细胞和韧皮纤维特征鉴别棉团铁线莲和东北铁线莲。采购的14批威灵仙药材中3批为威灵仙，2批为棉团铁线莲，9批为东北铁线莲。说明粉末显微可有效弥补横切面显微鉴别的不足。将粉末与横切面显微相结合，可快速高效地鉴别中药材威灵仙的3种基原，操作简单，显微特征明显，判别直观准确，具有很高的专属性和耐用性，对《中华人民共和国药典》现有显微鉴别方法是一个有力的补充。

关键词：威灵仙;基原鉴别;横切面显微;粉末显微

中图分类号： R282.5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）22-0234-04

中药材威灵仙按2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）规定有3种基原，分别为毛茛科植物威灵仙（Clematis chinensis Osbeck）、棉团铁线莲（Clematis hexapetala Pall.）、东北铁线莲（Clematis manshurica Rupr.）的干燥根和根茎，临床上主要用于治疗风湿痹痛、肢体麻木、筋脉拘挛、屈伸不利[1-2]。一直以来，市场上销售的威灵仙都只有产地信息，缺乏基原标志。尤其是近年来对威灵仙的需求量逐渐增加，使得威灵仙药材的基原问题更显凸出[3]，给临床应用带来了诸多的问题[4-5]。现有威灵仙鉴别的研究报道很多，包括性状[6]、高效液相色谱（HPLC）指纹图谱[7]、紫外光谱[8]、傅里叶变换红外光谱[9]、DNA分子鉴定技术[10-11]、薄层色谱[12]等多种技术手段，但均用于鉴别威灵仙及其铁线莲属伪品。中药材威灵仙3种基原的鉴别主要是依据2015年版《药典》收载的性状特征和横切面显微方法。但市场上的威灵仙多为切段药材，性状特征已经被破坏，而显微鉴别中的纤维束、石细胞等特征均为典型的粉末特征，采用横切面显微方法观察时，特征不明显，判别难度大，棉团铁线莲和东北铁线莲的区分难度大，方法的专属性和耐用性均有待进一步提高。有学者采用近红外光谱[13]区分威灵仙和东北铁线莲，但近红外仪器价格昂贵，且仍旧无法解决3种基原的鉴别问题，尤其是棉团铁线莲和东北铁线莲的鉴别。本研究将在威灵仙现有的《药典》方法基础上，采用粉末显微和横切面显微相结合，以期建立1种简单快捷、特征直观的显微鉴别方法，进一步完善《药典》方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

FA2004型电子天平（上海图新电子科技有限公司）;BM2000生物数码显微图像分析系统（合肥诺瑞科学仪器有限公司）;歌能G-100S型超声波清洗仪（深圳市歌能清洗设备有限公司）;JP-100A-2高速多功能粉碎机（上海市久品工贸有限公司）;40、60、80、100、125目标准检验筛（浙江省上虞市道墟张兴纱筛厂）;25.4×76.2 mm载/盖玻片（武汉致诚信达科技开发有限公司）;TS-DI10-L/H型实验室超纯水机（陶氏水处理设备工程有限公司）。

威灵仙药材购于安徽亳州药材市场和淮安市各大药房，共计8个产地，14个批次，具体信息见表1。各药材样品均保存于江苏省特色资源开发与药用重点实验室。无水乙醇（色谱纯，天津基准化学试剂有限公司）;氢氟酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;藏红T（生物染色剂，国药集团化学试剂有限公司）;固绿FCF（生物染色剂，上海沃凯生物技术有限公司）;盐酸（分析纯，南京奥佳化工有限公司）;二甲苯（分析纯，上海沃凯生物技术有限公司）;中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）;水合氯醛（分析纯，上海展云化工有限公司）。水为笔者所在实验室自制超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 横切面切片 分别取14批威灵仙药材，选取根部大小适中者用15%氢氟酸进行软化24 h，用流水冲洗至中性，切成薄片，放至盛有蒸馏水的培养皿中;挑选切面完整透明且薄厚均匀的切片放入50%乙醇溶液中脱水5 min，用番红染液染色30 min， 移入50%乙醇脱色5 min， 进而转入含1.0～1.5 mmol/L盐酸的70%乙醇中脱色2～3 h;用固绿染液染色1～2 s，再用95%乙醇溶液冲洗掉多余染液，放入无水乙醇中脱色5 min;在二甲苯和无水乙醇溶液（体积比1 ∶ 1）中透化 5 min，在二甲苯中透化5 min，用中性樹胶制片，并在显微镜下观察、拍照并保存图像。

1.2.2 横切面切片条件考察

1.2.2.1 番红染液染色时间 本研究分别考察番红染液染色时间对切片染色效果的影响，结果见表2。由此看出，番红染色的最佳时间为30 min，此条件下染色完成后的切片不同部位颜色区别明显，易观察。

1.2.2.2 固绿染液染色时间 本研究考察固绿染液染色时间对切片染色效果的影响，结果见表3。由此看出，固绿染液染色的最佳时间为1～2 s，此条件下染色完成后的切片不同部位颜色区别明显，易观察。

1.2.2.3 番红染液脱色条件 本研究考察了番红染液脱色时，70%乙醇中的盐酸浓度及脱色时间对切片脱色效果的影响。切片经50%乙醇脱色5 min后，再分别用含有不同浓度盐酸的70%乙醇脱色一定时间，观察脱色效果。由表4可知，切片脱色时的70%乙醇中盐酸浓度为1.0～1.5 mmol/L较适宜。

2 结果与分析

2.1 横切面切片显微特征分析