胡波 魏后军 范志宇

摘要：为获得可溶性表达的兔NF-κB p50蛋白，本研究对兔p50基因进行大肠杆菌密码子优化及合成，并连接于原核表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌Origami B（DE3）菌株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，获得GST-p50融合蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，GST-p50蛋白主要以可溶形式高效表达。经谷胱甘肽S转移酶（GST）磁珠纯化及蛋白免疫印迹（western blot）鉴定，所表达的GST-p50蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步开展兔NF-κB互作蛋白及信号通路的研究奠定了基础。

关键词：NF-κB;p50蛋白;原核表达;鉴定;兔

中图分类号： S858.291  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）22-0223-03

NF-κB家族是细胞中一类重要的转录调控因子，包含RelA（p65）、RelB、C-Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）5个成员。该蛋白家族成员以同源或异源二聚体形式存在，包括p50同源二聚体、p65同源二聚体和p50/p65异源二聚体等，其中p50/p65异源二聚体是NF-κB最广泛的形式[1]。NF-κB在免疫应答、炎症反应、细胞增殖和凋亡中均发挥重要的调控作用[2-4]，对其的研究一直是信号转导和免疫学研究领域的热点。

p50蛋白含有大小为24 ku的NF-κB同源结构域Rel homology domain（RHD），具有DNA结合、二聚化及核转位等功能，在NF-κB介导的调控作用中发挥重要作用[5]。研究发现，p50同源二聚体对机体的炎症反应有抑制作用，且HDAC1与p50的相互作用能抑制炎症相关基因的表达[6]。此外，p50在肾细胞癌及胶质母细胞瘤中也发挥重要的调控作用，p50的缺失可降低肿瘤生长并延长生存期[7-9]。

兔作为一种重要的试验动物，其NF-κB分子及其调控机制的研究尚未展开，在各种病理状态下其NF-κB通路的激活/抑制及其关键分子的作用研究均缺乏相应的基础和手段。本研究通过表达NF-κB p50亚基，以期为研究兔NF-κB通路调控机制及在相关疾病中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

序列优化的NF-κB p50基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并连接于pGEX-4T-1載体;E.coli Origami B（DE3）感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

1.2 主要试剂和工具酶

Blue Plus Ⅱ Protein Marker（蛋白分子量标准，北京全式金生物技术有限公司）;SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;兔抗人NF-κB p50蛋白多克隆抗体（南京善本生物科技有限公司）;酶标山羊抗兔IgG（HRP-IgG）购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;GST磁珠购自南京金斯瑞生物科技有限公司;氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾等试剂均为国产分析纯。

1.3 兔NF-κB p50蛋白的序列分析

以DNAStar软件对p50蛋白序列进行氨基酸比对及功能区分析，并采用Disulfind在线工具（http：//disulfind.dsi.unifi.it/）进行二硫键预测及分析。

1.4 重组表达载体pGEX-4T-1-p50的获得

采用OptimumGeneTM软件对兔p50基因序列（GenBank No.XM017347386）进行大肠杆菌密码子优化，优化序列经合成后连接至pGEX-4T-1载体中，获得重组表达载体 pGEX-4T-1-p50。

1.5 GST-p50融合蛋白的诱导表达

将重组质粒pGEX-4T-1-p50转化大肠杆菌Origami B（DE3）菌株，挑取单菌落接种到含氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）和四环素（20 μg/mL）的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，按1 ∶ 100体积比将培养物接种于含以上3种抗生素的新鲜LB液体培养基中，振荡培养至D600 nm值为0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），16 ℃诱导表达过夜，12 000 r/min 离心收集菌体，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬后冰浴超声破碎，分别收集上清和沉淀，进行12% SDS-PAGE电泳分析。

1.6 GST-p50蛋白的纯化及蛋白免疫印迹（western blot）鉴定

按“1.5”节的方法大量诱导表达GST-p50蛋白，经超声破碎后，12 000 r/min离心收集上清液，采用GST磁珠纯化目的蛋白，具体操作按GST磁珠说明书进行。将纯化后的GST-p50蛋白进行SDS-PAGE，采用半干转印法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以针对p50的多克隆抗体（1 ∶ 1 000 稀释）为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG（1 ∶ 5 000稀释）为二抗进行反应，ECL（增强化学发光法）显色观察结果。

2 结果与分析

2.1 兔p50序列分析

以DNAStar软件对p50序列进行分析，结果表明，兔p50基因全长1 299 bp，编码432个氨基酸。参照已报道的人p50蛋白NTD、DD、Linker和Flexible region等区域划分，通过氨基酸序列比对，发现兔p50蛋白同样存在相同的功能区（图1）。对兔p50基因编码蛋白的进一步分析显示，兔p50蛋白的相对分子质量为47 404.83，等电点（pI）为7.46，序列中共含有7个半胱氨酸（Cys）。通过Disulfind在线工具进行二硫键预测，结果表明，p50蛋白单体共可形成3对二硫键，分别位于NTD区和Linker区（表1）。

2.3 GST-p50蛋白的表达及纯化

将重组质粒pGEX-4T-1-p50转化E.coli Origami B（DE3）菌株，经IPTG诱导表达，超声破碎后，上清和沉淀的SDS-PAGE电泳结果显示，在约76 ku处有1条明显的蛋白条带，与预期大小一致（图2），表明重组GST-p50蛋白主要以可溶形式表达。经Image J软件分析，上清中GST-p50蛋白量是包涵体的3.07倍（图3）。

2.4 GST-p50蛋白的纯化及鉴定

采用GST磁珠对表达上清中GST-p50蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳表明，获得了纯化的GST-p50蛋白，Western Blot鉴定结果显示，所表达纯化的融合蛋白能被p50抗体特异性识别（图4），表明p50蛋白表达正确。

3 讨论

获得大量纯化的蛋白质是蛋白质理化性质和功能研究的基础，迄今大肠杆菌表达系统由于其遗传背景清楚、表达高效、经济方便等特点仍然是最常用的蛋白质表达系统。大肠杆菌表达外源蛋白可分为胞外分泌、周质表达和胞质表达3种形式。胞质表达方式的蛋白质表达量最高，但易形成无活性的包涵体，须经过复杂的变性复性过程才能得到有活性的目的蛋白[10]，因此提高蛋白的可溶性表达是原核表达中须要重点考虑的因素之一。

已有研究表明，人源和猪源NF-κB p50蛋白质在大肠杆菌中均以包涵体形式表达，须进行变性、复性、纯化等一系列处理才能用于后续研究[1，11]，且蛋白复性的效率并不高。目前普遍认为包涵体的形成是因为二硫键错配导致错误折叠的结果，且优化密码子、降低表达温度、分子伴侣、融合表达可溶性多肽等方法是提高蛋白质可溶性表达的主要策略[12-15]。因此本研究中，首先对p50蛋白质序列及二硫键形成进行了分析，发现p50序列含有7个半胱氨酸，其中6个可形成3对二硫键，分别位于NTD和Linker区域。这些二硫键在表达过程中能否正确折叠和配对可能对所表达的p50蛋白质的可溶性及活性十分关键。因此本研究选择了可高效促进蛋白二硫键正确折叠的Origami B（DE3）大肠杆菌作为表达宿主菌。此外，优化p50基因序列密码子、采用GST融合表达载体及16 ℃低温诱导等方法，成功表达了p50蛋白质。经分析，其可溶性蛋白表达量是包涵体的3倍以上，实现了p50蛋白质的高效可溶表达，为后续p50相互作用蛋白质及NF-κB信号通路的研究奠定了基础。

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