陆畅畅 续力云 吴丽萍

流行病学调查发现，人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈鳞状上皮病变的必要因素[1]。持续性高危型HPV感染（如 HPV-16、-18、-31、-33 和-58）是宫颈癌发生、发展的必要前提[2]。HPV早期区E6、E7基因编码蛋白是非常理想的宫颈癌治疗性靶蛋白，因为它们仅由病毒蛋白构成，却可在宿主细胞中表达；因此，一旦破坏体内表达HPV E6、E7蛋白的细胞，就能阻止肿瘤的发生，同时破坏已经癌变的肿瘤组织，而这样的治疗策略的实施依赖于细胞免疫的参与[3-4]。树突状细胞（DC）作为人体内已知的抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞，成为当前抗病毒免疫和肿瘤免疫治疗的研究热点之一[5]。DC能摄取、加工抗原，表达高水平主要组织相容性复合体（MHC）等有助于抗原提呈的分子，有效地向T淋巴细胞提呈抗原，启动患者自身特异性免疫反应。细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞是新型的免疫活性细胞，是由多种细胞因子诱导产生的杀伤细胞；其兼具T淋巴细胞强大的杀伤活性和NK细胞的非MHC限制性杀伤特点[6-7]。然而，目前临床无论是DC疫苗还是CIK细胞单独应用于抗肿瘤或抗病毒治疗，效果均不是特别理想[8-9]。负载靶抗原的DC与CIK细胞联合应用时，DC可增强CIK细胞的免疫应答，CIK细胞的非MHC限制性可弥补DC MHC限制性的不足，两者的互补作用产生双重杀伤效应[10-11]。因此，抗原致敏DC-CIK细胞的联合应用，是宫颈癌细胞免疫治疗的有益探索。本研究应用流式细胞术、ELISA法检测HPV-16 E7负载DC对CIK细胞表型及细胞因子分泌水平的影响，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测HPV-16 E7负载DC-CIK细胞对宫颈癌细胞的杀伤活性，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 细胞因子：IL-2、IL-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN-γ及IL-1α购自美国Pepro Tech公司。单克隆流式抗体：抗人PE-CD3、FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8、FITC-CD14、FITCCD56、APC-CD83、PerCP-Cy5.5-CD86和 PE-HLA-DR单抗，同型对照抗体 APC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG1及PerCP-Cy5.5-IgG1均购自美国BD公司。Alys-505培养液、RPMI 1640培养基、FBS、杜氏磷酸缓冲液（DPBS）、PBS购自美国Gbico公司。ELISA法检测IL-12、IFN-γ、TNF-α的试剂盒均购自美国R&D公司。人外周血淋巴细胞分离液购自中国天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。CytoTox 96R非放射性细胞毒性检测试剂盒（CytoTox 96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay）购自美国Promega公司。HPV-16 E7载体与阴性对照载体购自上海吉玛公司。宫颈癌Hela细胞株购自中国科学院干细胞库。FACS CaliburTM流式细胞仪为美国BD公司产品，酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DC的分离培养 抽取26例健康志愿者外周血各 20ml，肝素抗凝，离心 900g，30min；吸取上层血浆，置于 56℃水浴锅中 30min，随后 4℃静置 15min，离心800g，15min；取上层血浆4℃保存备用。另取离心后细胞沉淀，加D-PBS混匀，缓慢加到装有10ml淋巴细胞分离液的离心管中，室温离心吸取白膜层细胞，用含10%血浆的Alys-505培养液重悬细胞，以5×106/ml细胞密度接种于6孔板，于饱和湿度、37℃、5.0%二氧化碳培养箱中培养2h。保留贴壁细胞于6孔板中，于含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4及10%血浆的Alys-505培养液中继续培养，此即为分离的DC，第3天时半量换液并补充新鲜的细胞因子。

1.2.2 CIK细胞的诱导培养 取DC的分离培养过程中未贴壁细胞，用含0.5%血浆的Alys-505培养液调整细胞密度为1×106/ml，转入6孔板，同时每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于饱和湿度、37℃、5.0%二氧化碳培养箱中培养。24h后，每孔分别加入50ng/ml CD3单抗，1000U/ml IL-2及1000U/ml IL-1α继续培养。每3d调整细胞密度为1×106/ml，于含1000U/ml IL-2及0.5%血浆的Alys-505培养液中培养，第8天收获CIK细胞。

1.2.3 DC-CIK细胞的共培养 将分离的DC与诱导的CIK细胞以1∶10比例共同培养，每2d补充含0.5%血浆、1000U/ml IL-2、100ng/ml GM-CSF 的 Alys-505培养液，共培养5～7d后收获DC-CIK细胞备用。

1.2.4 流式细胞术检测细胞表型

1.2.4.1 HPV-16 E7负载DC细胞表型检测 应用HPV-16 E7载体与阴性对照载体转染DC，取转染后第3天的 DC 2×106个，重悬于 200μl PBS，均分入 2管。对照管添加1μl荧光素标记的同型对照抗体（APC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG1 及 PerCP-Cy5.5-IgG1），实验管添加 1μl荧光素标记的抗人抗体（APC-CD83、FITCCD14、PE-HLA-DR 及 PerCP-Cy5.5-CD86）。室温避光孵育 30min，分别加 1ml PBS，离心 400g 5min，弃 PBS，重复3次，最后以500μl PBS重悬细胞，上机检测HPV-16 E7负载DC细胞与阴性对照负载DC细胞表型。

1.2.4.2 HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞表型检测 取最终培养的HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞各4×106个，重悬于 400μl PBS，均分入 a、b、c、d 管，a 管添加 1μl荧光素标记的同型对照抗体（PE-IgG1、FITC-IgG2a），b管添加1μl荧光素标记的同型对照抗体（FITC-IgG2a、APC-IgG1、PE-IgG1），c 管添加 1μl荧光素标记的抗人抗体（PE-CD3、FITC-CD56），d管添加 1μl荧光素标记的抗人抗体（FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8）。室温避光孵育30min，以上各管各添加1ml PBS，离心400g 5min，弃PBS，重复3次，500μl PBS重悬沉淀，应用 FACS CaliburTM流式细胞仪进行检测，FlowJo软件（美国）进行数据分析。

1.2.5 HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞的细胞因子表达水平检测 采用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平。具体步骤参照试剂说明书，绘制吸光值（OD值）与样本浓度的标准曲线，根据标准曲线确定样品浓度。

1.2.6 HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞对宫颈癌Hela细胞的杀伤活性检测 采用LDH释放法。以含5%FBS RPMI 1640培养基悬浮的Hela细胞作为靶细胞，加入96 孔板，每孔 1×104个细胞/50μl。以 HPV-DC-CIK、DC-CIK、CIK细胞为效应细胞，按不同效靶比加入相应数量的效应细胞50μl。另设培养基对照孔，效、靶细胞自然释放孔，靶细胞最大释放孔，各组均设3个复孔。具体步骤参照试剂说明书，最后，根据孔内于490nm处测吸光值（OD值）计算各组CIK细胞杀伤活性，杀伤活性（%）=（实验组OD值-靶细胞自然释放组OD值-效应细胞自然释放组OD值）/（靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值）×100%。

1.3 观察指标 （1）比较HPV-16 E7负载DC与阴性对照负载DC表型；（2）HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞表型；（3）比较HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞分泌的细胞因子水平；（4）比较HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞对宫颈癌Hela细胞的杀伤活性。1.4 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件；计量资料以表示，两组比较采用两独立样本t检验；多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV-16 E7负载DC与阴性对照负载DC表型比较见表1。

表1 HPV-16 E7负载DC与阴性对照负载DC表型比较（n=26，%）

由表1可见，与阴性对照负载DC比较，HPV-16 E7 负载 DC 中 CD83+、CD86+、HLA-DR+DC 细胞比例均上调（均P＜0.05），CD14+DC 细胞比例下调（P＜0.05）。2.2 HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DCCIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞表型比较见表2。

表2 HPV-16E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞表型比较（n=26，%）

由表2可见，HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞的细胞表型比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与其他3组细胞比较，HPV-16 E7负载DC-CIK细胞中CD3+CD4+CIK 细胞比例下调（P＜0.05），CD3+CD8+、CD3+CD56+CIK细胞比例均上调（均P＜0.05）。

2.3 HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞分泌的细胞因子水平比较见表3。

表3 HPV-16E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞分泌的细胞因子水平比较（n=26）

由表3可见，HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞中L-12、IFN-γ、TNF-α水平比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与其他3组细胞比较，HPV-16 E7负载DC-CIK细胞 IL-12、IFN-γ、TNF-α 水平均上调（均P＜0.05）。

2.4 HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞对宫颈癌Hela细胞的杀伤活性比较见图1。

由图1可见，HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞对宫颈癌Hela细胞的杀伤活性比较差异有统计学意义（P＜0.05）。HPV-16 E7负载DC-CIK细胞对宫颈癌Hela细胞的杀伤活性最强（均P＜0.05），DC-CIK细胞次之（P＜0.05）。

图1 HPV-16 E7负载DC-CIK细胞、阴性对照负载DC-CIK细胞、DC-CIK细胞、CIK细胞对宫颈癌Hela细胞的杀伤活性比较（n=26；CIK细胞 vs DC-CIK细胞，*P＜0.05；阴性对照负载DC-CIK细胞vs HPV-16 E7负载-DC-CIK细胞，**P＜0.01）

3 讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，占全世界妇女癌症病死率第2位；HPV是宫颈癌的主要致病因子，几乎所有的宫颈癌发病都与高危型HPV感染有关[1-2]。E6、E7蛋白是高危型HPV的主要致癌蛋白，只表达于HPV感染组织中，在正常组织中不表达，其中E7蛋白主要通过结合并降解成视网膜母细胞瘤蛋白而使其丧失抑癌功能，因此E6、E7蛋白是宫颈癌治疗的理想靶蛋白[4,12]。本研究应用HPV-16 E7载体转染人外周血来源DC，得到HPV16 E7负载DC，并发现HPV16 E7特异性负载可促使DC成熟，与阴性对照负载DC相比，细胞表面标志物CD83、CD86及HLA-DR表达上调，CD14表达下调。CD83、CD86及 HLA-DR分子均为T淋巴细胞活化的标志分子[13-15]，免疫细胞功能的实施与细胞活化状态密切相关，CD83、CD86及HLA-DR表达上调，利于肿瘤细胞的清除。

CIK细胞是在多种细胞因子即IL-2、IL-1、IFN-γ及抗CD3单克隆抗体等存在的条件下，应用外周血、骨髓或脐血中分离出的单个核细胞，经过一定时间培养而获得的非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T细胞，在外周血淋巴细胞的比例仅为1%~5%；它兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，在肿瘤免疫治疗中起到了不可替代的作用[16-17]。CIK细胞表面不表达Fc受体，不能产生抗体依赖性细胞毒反应，DC与CIK细胞共培养既可发挥CIK的非限制性细胞毒反应，又可激发抗原负载的DC介导的MHC限制性细胞毒反应，增强特异性杀伤作用。研究表明，经DC刺激后的CIK细胞活性显著增强[10-11]。本研究结果也发现，经过HPV-16 E7负载DC共培养的CIK细胞，CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例均上调，细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α 的水平亦均上调，CIK 细胞表现出更强的宫颈癌Hela细胞杀伤活性。

综上所述，HPV-16 E7负载DC不仅能激活CIK细胞，还可增强CIK细胞的宫颈癌细胞杀伤效应。HPV-16 E7负载DC与CIK细胞的协同作用对宫颈癌的细胞免疫治疗具有重要意义。