颜 婷 黄 浩

(福建师范大学生命科学学院/福建师范大学国家级生物学实验教学示范中心 福州 350117)

2017年11月27日，世界上首例体细胞克隆猴“中中”在中国科学院神经科学研究所诞生；12月5日第二只克隆猴“华华”诞生[1]，这一举世瞩目的成果标志着人们成功攻克克隆灵长类动物的世界性难题，确立了我国在非人灵长类研究领域的领先优势。本文对动物克隆的研究历程、研究现状以及克隆猴诞生对生命科学、临床医学和社会伦理学的影响进行概述。

1 动物克隆的历史回顾

“克隆”一词是英语“clone”的音译，究其词源，是植物学家借由希腊语“细枝”(klon)衍生而来，用于表示植物的“无性繁殖”。后来“克隆”就成为一种利用生物学手段实现“无性繁殖”的技术总称。高等动物能否像植物那样进行克隆呢？长期以来科学家一直进行着不懈的研究。1935年,Spemann[2]设计了一个精巧的实验： 先用婴儿头发丝将蝾螈(Cynops)受精卵环缢结扎为带核侧(有细胞核)和无核侧(无细胞核)两部分，结果发现只有带核侧受精卵能够正常发育形成胚胎，而无核侧受精卵则发育停滞；如果将经过几次分裂的细胞核重新推到无核侧，则该侧受精卵又重新开始分裂并能发育成个体，且该个体比原先带核侧受精卵发育的个体更为“年轻”。这一实验结果证明了：“经过若干次分裂并初步分化的动物细胞核仍然具有发育成完整个体的能力”，也就是后来学术界普遍接受的“体细胞核具有全能性”观点的雏形。Spemann借此发现获得诺贝尔奖，人类由此开启了脊椎动物体细胞克隆技术的新时代。

1952年，Briggs和King[3]将黑斑蛙(Rananigromaculata)囊胚期细胞的细胞核移植到去核卵细胞,成功获得正常发育的蝌蚪,这是首次核移植动物克隆试验。1973年，我国生物学家童第周[4]成功得到克隆鱼(Piscium)。

然而这些动物都是体外受精和体外发育的，而哺乳动物多数是体内受精，且胚胎发育是在母体子宫中进行的，这大大增加了哺乳动物克隆研究的难度。上世纪80年代，科学家以小鼠正常囊胚的内细胞团细胞为核供体，移植并重构胚胎，在体外发育至桑葚胚或囊胚期后移植至代孕母鼠子宫，最终获得发育正常的幼鼠。此后，以胚胎细胞克隆技术为基础的动物，如山羊、牛、猪、兔和大鼠陆续克隆成功。我国科学家也在90年代相继得到类似的克隆哺乳动物。

1996年，Campbell和Wilmut[5]利用6岁成年绵羊乳腺上皮细胞成功得到第一只体细胞克隆哺乳动物—“多莉(Dolly)”。“多莉”羊的诞生证明了已经高度分化的成年动物的体细胞可以在适当条件下去分化，重编程后恢复其全能性。之后，科学家相继克隆出牛、小鼠和猫等20多种哺乳动物。1999年，我国科学家陈大元等[6]将成年大熊猫体细胞的细胞核作为供体，移植到去核兔卵母细胞中构建异种重构胚，体外培养获得孵化囊胚。这项研究成果被评为当年中国十大科技进展之一。

尽管科学家对非人灵长类动物的研究尝试早在“多莉”羊之前就已经开始，但是随着动物进化的等级升高，灵长类动物因其性成熟和妊娠期都相对较长，且生命维持机制非常复杂，克隆实验实施异常困难。

2 体细胞克隆猴的诞生

2002年，Mitalipov等以恒河猴的体细胞作为核供体进行核移植获得胚胎，再移入3只受体，尽管最终没有一只能怀孕，但这是人类首次利用非人灵长类动物体细胞开展体细胞核移植克隆研究。但之后的许多克隆研究都屡屡失败，最接近成功的一次是已经得到转入胚胎发育且能检测到心跳的克隆恒河猴胚胎，在妊娠81天以流产告终。

为什么灵长类体细胞克隆这么难呢？主要原因有： ①灵长类卵母细胞不透明，造成去核难度大；②灵长类卵母细胞敏感，极易提前激活，影响融合率；③体细胞细胞核在受体卵母细胞中重编程不完全，导致胚胎发育率低下。

中国科学院孙强团队针对这些困扰因素进行了针对性的技术优化： 首先，利用偏振光给卵母细胞“打光”，解决了卵母细胞不透明影响细胞核示踪的问题，并快速高效地完成去核操作，保持其活性；然后取来自幼猴纤维组织细胞，以HVJ-E病毒处理，采用压电驱动的显微操作方法注入去核卵母细胞并介导融合，既降低了卵母细胞的敏感性，又避免了对卵母细胞的挤压，减少细胞损伤；重组胚胎融合后1 h将其激活，将Kdm4d和TSA以合适配比注入激活后的胚胎，并培养一段时间，显著提高克隆囊胚的发育率。终于成功获得体细胞克隆食蟹猴——“中中”和“华华”[1]。

3 克隆猴带来的思考

体细胞克隆猴的诞生不仅证明了灵长类克隆的可能性，也为探索建立更接近人类的医学动物模型提供了新途径。目前，医学基础研究广泛采用小鼠模型，但这些研究成果却因为物种差异而不能简单平行迁移到人体水平直接应用。因此，在药物研发、药效评估等生物医学研究中还需使用实验猴，而体细胞克隆猴将能在一定程度上减少使用自然繁育实验动物。由于体细胞克隆猴基因背景近乎一致，解决了以往实验中灵长类动物个体差异大、实验可重复性差等问题。

克隆猴只是灵长类克隆技术研究的第一步，还存在需要进一步研究的问题： ①克隆猴其体细胞来源是流产的胎猴成纤维细胞，如果使用成年猴子的成纤维细胞或者其他类型细胞是否可行？②基因工程技术是否能运用于克隆猴研究，以得到特定疾病猴模型？③相关药物作用于重组胚胎早期发育，有利于提高囊胚发育率，但是它对胚胎着床后的发育影响还未确定。体细胞克隆猴的成功，标志着我国在克隆技术领域已经处于世界领先水平，将推动我国发展基于非人灵长类疾病动物模型的医药研发产业链，并促进灵长类全脑图谱计划的实施和灵长类脑科学的尖端研究。

伴随着克隆猴的成功，“克隆人”的话题再度引起人们的关注和热议。毕竟人与猴在生理结构上高度相似，非人灵长类动物的成功克隆也在一定程度上证明了“克隆人”的理论可行性。由此引发的科技伦理风险也需要我们加以重视，国家层面上要尽快立法规范，构建防范科技恶意使用的法律“防火墙”；学术领域内要建立预警、应急措施和技术储备，通过建立科技伦理准则，规约高新技术，防止其被滥用、盗用甚至恶用。