徐 佳，王 萱，游 燕，薛华丹，王 勤，王士阗，金征宇

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1放射科 2病理科，北京 100730

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的关键且必经的过程，并最终导致终末期肝病[1]，对肝纤维化的早期合理诊断对改善慢性肝病预后具有重要意义[2-3]。目前，肝穿刺活检仍是肝纤维化诊断及分期的“金标准”，然而其为有创性操作，不利于长期随访、观察疾病进展和评价药物疗效。现有的肝纤维化评价替代技术包括实验室血生化指标、超声弹性成像、CT、磁共振等[4-6]，但尚未有能够真正代替肝穿刺活检的检查手段。钆塞酸二钠(gadolinium ethoxybenzyl diethylene-triamine-pentaacetic-acid，Gd-EOB-DTPA)是一种肝脏特异性的磁共振对比剂[7]。在肝脏纤维化过程中，肝脏的灌注、血管通透性、细胞外弥散、肝细胞功能及转运体表达均会发生变化，而Gd-EOB-DTPA具有血池对比剂及肝细胞对比剂的双重特性，在肝脏显影的动脉期和门脉期，主要分布于血管内或血管外细胞外间隙中，反映肝脏灌注信息在肝胆期(约注射对比剂20 min后)被正常肝细胞特异性摄取的特性，提供肝细胞功能信息，于是，Gd-EOB-DTPA动态增强磁共振就具备了同时定量分析肝脏灌注和肝细胞功能的潜力[8-9]。因此，本研究通过构建肝毒性肝纤维化动物模型，应用Gd-EOB-DTPA动态增强磁共振成像技术，以病理学为金标准，研究肝纤维化进程中灌注和多期肝胆期影像学特征与纤维化分级的相关性。

材料和方法

实验动物及分组采用雄性SD大鼠60只，6～7周龄，体重180～220 g，购于维通利华公司。将60只大鼠使用简单随机分组法分为正常对照组(n=15)、实验组1(n=15)、实验组2(n=15)、实验组3(n=15)。

动物模型建立采用40%四氯化碳溶液腹腔注射法构建大鼠病毒性肝纤维化模型，剂量为3 μl/g体重，每周2次，分别注射4周(实验组1)、8周(实验组2)、12周(实验组3)，以制备不同程度的肝纤维化模型。对照组腹腔注射等量的生理盐水。

血透明质酸测定4组大鼠于扫描前2天采用剪尾尖采血法取血(每只约1 ml)，采血前停止腹腔注射四氯化碳1周，以避免肝脏急性期炎症反应对血生化指标的影响。应用透明质酸(hyaluronic acid，HA)定量测定试剂盒测定血浆HA含量。

磁共振扫描扫描采用临床3.0T磁共振扫描设备(Siemens MAGNETOM Skyra 3.0T，德国)及16通道腕关节线圈。对比剂采用钆塞酸二钠稀释10倍(0.025 mmol/ml)，注射剂量不变，即实际注射的对比剂体积为3 μl/g大鼠体重。扫描前用2%戊巴比妥钠溶液对大鼠进行腹腔注射麻醉，将其仰卧位固定，经尾静脉置入留置针。

扫描序列包括平扫、快速动态增强扫描及肝胆期多期扫描。平扫包括冠状位T2加权快速自旋回波序列(T2-weighted turbo spin-echo，T2 TSE)[重复时间(repetition time，TR)=3770 ms，恢复时间(echo time，TE)=62 ms，视野(field of view，Fov)=95 mm×160 mm，层厚=2.0 mm]、轴位T2 TSE (TR=5000 ms，TE=62 ms，Fov=80 mm×160 mm，层厚=2.0 mm)、轴位T1 TSE (TR=800 ms，TE=11 ms，Fov=80 mm×160 mm，层厚=2.0 mm)。快速动态增强扫描采用快速TWIST-VIBE序列(TR=6.22 ms，TE=2.46 ms，Fov=90 mm×200 mm，层厚=2.0 mm)，3s/期，共连续扫描60期，于第3期扫描开始时通过尾静脉置管快速团注Gd-EOB-DTPA对比剂；肝胆期扫描采用单期TWIST-VIBE序列，于注射对比剂后每隔5分钟成像1次，共12期(60 min)。扫描全部时长约为80 min。

图像处理分析采用Siemens多功能图像后处理工作站MMWP上的Tissue 4D软件，采用Tofts普适动力学模型处理动态增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced-magnetic resonance imaging,DCE-MRI)数据，通过在肝右叶勾画感兴趣区域(图1A)得到DCE的相对强化率-时间曲线(图1B)，确认DCE扫描成功，可进行下一步处理，进一步得到容量转运常数(transfer constant，Ktrans)、速率常数(reverse rate constant，kep)、血管外细胞外间隙体积百分数(extravascular extracellular volume fraction，Ve)及初始曲线下面积(initial area under curve，iAUC)伪彩图。选取肝脏最大层面及其上下各一层面共3个层面，于每个层面的右半肝勾勒感兴趣区域(图1A)，面积0.3～0.5 cm2，注意避开血管区，取平均值得到肝脏定量灌注参数Ve、Ktrans、Kep及iAUC。

采用动态均值曲线工具包，选取肝脏最大层面及其上下各一层面共3个层面，于每个层面的右半肝勾勒感兴趣区域，绘制肝脏信号强度(signal intensity，SI)-时间特征曲线(图1C)，取3个层面信号强度平均值，获得半定量灌注参数包括达峰时间(time of maximum relative enhancement，Tmax)、最大相对强化率(maximum relative enhancement，REmax)。

测定肝胆期内各时间点(打药后5～60 min)肝脏SI，计算肝胆期内各时间点肝脏的相对强化率(relative enhancement，RE)[RE=(肝胆期SI-平扫SI)/平扫SI)]。绘制肝胆期肝脏RE-时间曲线，计算获得3 min与60 min的RE差值(RE下降=RE3 min-RE60 min)。由于Gd-EOB-DTPA的消除过程学符合一级动物消除力学，对各期RE进行对数曲线拟合，得到Gd-EOB-DTPA消除曲线，计算获得肝脏信号降低一半的时间(elimination half-life of RE，TRE1/2)。

病理学分析完成磁共振扫描后，将大鼠过量麻醉处死后立即解剖，取部分右叶肝脏用于病理学分析，采用HE染色及Masson染色，利用METAVIR分期系统进行病理学分期(F0：无纤维化；F1：汇管区纤维化；F2：少量的汇管区-中央静脉纤维桥或纤维分隔；F3：大量的汇管区-中央静脉纤维桥或纤维分隔；F4：早期肝硬化)。本研究定义F1～F2期为轻度肝纤维化，F3～F4期为重度肝纤维化。

图1肝右叶感兴趣区位置(红圈1)(A)及生成的动态增强相对强化率-时间曲线(B)、多期肝胆期平均信号强度-时间曲线(C)

Fig1Images indicating the region of interest (red circle 1) drawn in the right liver lobe (A)，and the calculated relative enhancement-time curve of dynamic contrast enhanced phase (B)，and mean signal intensity-time curve of multiple hepatobiliary phase (C)

统计学处理数据分析采用SPSS 21.0软件，资料用均数±标准差表示。采用单因素方差分析(One way ANOVA)比较3组肝纤维化期别的功能磁共振成像参数(不同时间点相对强化率、TRE1/2、Ktrans、Ve等)、血生化指标(HA)差异是否有统计学意义，并运用多重比较(LSD)，进一步检验组对之间差异是否存在统计学意义。采用Spearman秩相关检验计算相关参数与纤维化分期的相关性。运用受试者工作曲线(receiver-operator curves，ROC)分析磁共振成像参数对诊断肝纤维化分期的敏感性和特异性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

病理结果27只大鼠于四氯化碳注射模型制备中死亡，2只大鼠于麻醉时死亡，最终31只大鼠成功完成磁共振检查及病理学检查。其中病理分期为正常的10只、轻度肝纤维化10只、重度肝纤维化11只。HE及Masson染色分别显示汇管区无纤维化(F0)，汇管区纤维组织轻度增生(F1)，汇管区-中央静脉间桥接纤维间隔形成(F3)，早期肝硬化、肝小叶结构紊乱、纤维间隔形成(F4)(图2)。

灌注参数与肝纤维化分级随着肝纤维程度的加重，Ktrans、Ve、iAUC呈下降趋势(相关系数分别为r=-0.631，P=0.002；r=-0.503，P=0.017；r=-0.446，P=0.037)。Ktrans和Ve组间差异具有统计学意义(F=7.011，P=0.005；F=4.656，P=0.023)，正常组和重度肝纤维化组间差异具有统计学意义(P=0.001，P=0.009)。Tmax组间差异具有统计学意义(F=6.633，P=0.005)，重度肝纤维化组的Tmax显著长于轻度肝纤维化组和正常组(P=0.004，P=0.005)。REmax组间差异无统计学意义(表1)。从正常到重度肝纤维化，Ktrans，Ve和iAUC呈下降趋势(图3)。

F0：正常汇管区，无纤维化表现(×400)；F1：汇管区纤维组织轻度增生，汇管区略扩大(×200)；F3：汇管区-中央静脉间桥接纤维间隔形成(×200)；F4：早期肝硬化，肝小叶结构紊乱，纤维间隔形成(×40)

F0：normal liver parenchyma，without liver fibrosis (×400)；F1：enlargement of portal tract with rare septa formation (×200)；F3：fibrous septa bridging portal triads and central veins(×200)；F4：early cirrhosis，nodules of liver parenchyma separated by thick fibrous bands(×40)

图2不同肝纤维化分级的HE及Masson染色结果

Fig2HE and Masson staining of liver tissues at different liver fibrosis stages

表1 不同病理学分期下灌注参数比较Table 1 Comparisons of perfusion parameters in different liver fibrosis

Ktrans：转运常数；kep：速率常数；Ve：血管外细胞外间隙体积百分数；iAUC：初始曲线下面积；Tmax：达峰时间；REmax：最大相对强化率；与正常比较，aP=0.047，bP=0.001，cP=0.009，dP=0.005；与轻度纤维化比较，eP=0.004

Ktrans：transfer constant；Kep：reverse rate constant；Ve：extravascular extracellular volume fraction；iAUC：initial area under curve；Tmax：time of maximum relative enhancement；REmax：maximum relative enhancement；aP=0.047，bP=0.001，cP=0.009，dP=0.005 compared with normal；eP=0.004 compared with mild fibrosis

图3正常组和重度肝纤维化组的Ktrans、Kep、Ve和iAUC伪彩图

Fig3Ktrans，Kep，Veand iAUC of normal group and advanced fibrosis group

在区分正常与轻、重度肝纤维化时，Ktrans、Ve的ROC曲线下面积分别为0.857(95%CI=0.689～0.989，P=0.006)、0.813(95%CI=0.607～0.939，P=0.017)；Ktrans临界值小于0.647时，区分轻度肝纤维化与正常肝脏的敏感性与特异性分别为66.7%和66.7%，Ve界值小于0.395时，Ve的敏感性与特异性分别为88.9%和83.3%。在诊断重度肝纤维化时，Ktrans、iAUC的ROC曲线下面积分别为0.821(95%CI=0.646～0.995，P=0.012)、0.761(95%CI=0.548～0.973，P=0.042)；Ktrans临界值小于0.525时，诊断重度肝纤维化的敏感性与特异性分别为80.0%和78.9%，iAUC临界值小于13.77时，诊断重度肝纤维化的敏感性与特异性分别为80.0%和73.7%。

多期肝胆期参数与肝纤维化分级不同病理学分级的多期肝胆期参数包括在3、 20、 45、 50、 55 和60 min的RE值、RE下降和 TRE1/2。RE45 min、RE50 min和RE55 min组间差异具有统计学意义(F=3.994，P=0.030；F=5.276，P=0.020；F=5.189，P=0.002)，重度肝纤维化组的RE45 min、RE50 min和RE55 min显著高于轻度肝纤维化组(P=0.011，P=0.007，P=0.001)。重度肝纤维化组的RE55 min和RE60 min显著高于正常组(P=0.006，P=0.014)。RE3 min和RE20 min组间差异无统计学意义。随着肝纤维程度的加重，RE下降呈减少趋势(r=-0.616，P=0.006)，TRE1/2呈延长趋势(r=0.513，P=0.003)。TRE1/2、RE下降组间差异具有统计学意义(F=5.493，P=0.010；F=5.343，P=0.014)，重度肝纤维化组的TRE1/2显著长于轻度和正常组(P=0.008，P=0.008)，RE下降显著少于轻度和正常组(P=0.012，P=0.007)(表2)。

HA与肝纤维化分期随着肝纤维化程度的加重，HA逐渐升高，正常、轻度纤维化、重度纤维化组的HA值分别为(103.1±16.8) ng/ml、(136.3±38.7) ng/ml、(170.9±53.8) ng/ml，轻度、重度纤维化组显著高于正常组(P=0.027，P=0.002)，轻度、重度肝纤维化组间差异无统计学意义。

表2 不同病理学分期下多期肝胆期参数比较

RE3 min：3 min时的相对强化率；RE20 min：20 min时的相对强化率；RE45 min：45 min时的相对强化率；RE50 min：50 min时的相对强化率；RE55 min：55 min时的相对强化率；RE60 min：60 min时的相对强化率；RE下降=RE3 min-RE60 min；TRE1/2：相对强化率减半的时间；与正常比较，aP=0.006，bP=0.014，cP=0.007，dP=0.008；与轻度纤维化比较，eP=0.011，fP=0.007，gP=0.001，hP=0.012，iP=0.008

RE3 min：relative enhancement at 3 minutes；RE20 min：relative enhancement at 20 minutes；RE45 min：relative enhancement at 45 minutes；RE50 min：relative enhancement at 50 minutes；RE55 min：relative enhancement at 55 minutes；RE60 min：relative enhancement at 60 minutes；REchange=RE3 min-RE60 min；TRE1/2：elimination half-life of relative enhancement；aP=0.006，bP=0.014，cP=0.007，dP=0.008 compared with normal；eP=0.011，fP=0.007，gP=0.001，hP=0.012，iP=0.008 compared with mild fibrosis

讨 论

肝纤维化伴随着血管通透性、细胞外扩散和肝细胞转运体的表达变化，Gd-EOB-DTPA作为一种肝特异性对比剂，具有一定程度上反映这种变化的潜力[7]。Gd-EOB-DTPA增强MRI定量评价肝纤维化是近年研究的热点，在诊断肝纤维化方面，具有无创、利于随访等优势。既往研究表明，注射对比剂后20 min肝胆期相对强化率随着肝脏正常、肝纤维化、早期肝硬化的进展，呈下降趋势，具有定量评价肝纤维化的能力[10-15]，但对灌注参数以及多期肝胆期变化特征的研究尚有限[16]。本研究探讨了Gd-EOB-DTPA增强磁共振的快速动态增强期的灌注参数，以及肝胆期信号强度随时间变化特点相关参数对于肝纤维化分期诊断的价值。

本研究显示，随着肝纤维化程度进展，灌注参数Ktrans、Ve、iAUC均呈下降趋势。Ktrans、Ve、iAUC分别代表单位时间内每单位体积组织中从血液进入血管外细胞外间隙的对比剂量、单位体积组织内血管外细胞外间隙的体积以及对比剂流入肝脏的量，其原因可能为，随着肝纤维化程度的加重，细胞外基质沉积、内皮孔隙减小消失，血流减慢，血管通透性减低，进而使得对比剂的扩散减慢，在相同时间内对比剂流入肝脏的量减少。Zhang等[16]对大鼠肝纤维化模型研究显示，Ktrans、iAUC在重度肝纤维化中最大、在正常组中最小。本研究结果与前人结果类似，但既往研究中Ve组间差异无统计学意义，本研究表现为差异有统计学意义，其原因可能为肝纤维化细胞外基质沉积使得单位体积组织内血管外细胞外间隙的体积减小。也有既往研究得到不同结果，随着肝纤维程度增加，iAUC表现为下降趋势(与本研究结果类似)，但Ktrans则表现为升高趋势[17]；对于肝纤维化灌注参数的变化尚无定论。此外，半定量灌注参数分析结果显示，随着肝纤维化程度的加重，REmax逐渐减低，达峰时间(Tmax)逐渐延长。该结果与定量灌注参数结果相印证，两组参数共同提示肝纤维化程度加重，对比剂流入量减低、速度减慢。Tsuda等[18]利用大鼠脂肪性肝纤维化模型研究显示，随着其纤维化程度的进展，Tmax值延长，与本研究结果相符。

本研究显示，不同病理学分级中，肝胆期信号强度相关参数差异有统计学意义。重度肝纤维化组在较晚肝胆期(45 min、50 min、55 min和60 min)的相对强化率显著高于轻度或对照组，提示重度纤维化组在这些时点对比剂在肝细胞内滞留量较大。其可能的解释为，肝纤维化可导致肝细胞功能的下降：一方面体现为肝细胞对于对比剂摄取能力的减低，如既往研究所示，20 min肝胆期相对强化减低；一方面体现为肝细胞对于对比剂排泄能力的减低，即本研究结果所示。此外，本研究显示，重度肝纤维化组的对比剂减半时间(TRE1/2)更长、RE变化(REmax-RE60 min)较少，共同提示在重度肝纤维化中对比剂排泄减慢，在肝胆期较晚时间点上，更多的对比剂滞留在肝细胞内。已有研究显示，随着肝纤维化程度加重，有机阴离子转运多肽和多药耐药相关蛋白表达量降低[19-20]，多药耐药相关蛋白是位于肝细胞胆管面的转运蛋白，其减低可能导致对比剂排出能力减低，这也许是能够解释本研究发现的分子蛋白学机制。

本研究采用多期肝胆期并得到晚期肝胆期参数对于诊断肝纤维化的潜在价值，对晚期肝胆期的探讨提供了另一个可能用于定量评价肝纤维化的角度，即不仅是对比剂的摄取(常规的20 min肝胆期)，对比剂排泄的评估也具有潜在应用价值。针对扫描时间较长、不利于临床应用转化的问题，可考虑在实际应用中，用分次扫描的方法减少占用机时。

本研究存在一些局限性。首先，样本量相对较小，并非均匀分布在F0～F4期，所以统计时将病例分为了正常(F0)、轻度(F1～F2)和重度(F3～F4)组；进一步研究有待增大样本量。其次，本研究采用的是单输入Tofts模型，而肝脏是动脉、门脉双血供器官，采用双输入模型更加符合肝脏的生理状态。但由于全部样本均采用同一方法计算数据，可将模型拟合的不足视为系统误差，不同组间计算值具有可比性，既往也有肝纤维化研究采用这一模型[16-17]。

综上，本研究提示Gd-EOB-DTPA增强MRI灌注参数与多期肝胆期强化参数对于肝纤维化的诊断及分级具有一定价值。