Nogo-A对突触可塑性的调节及相关神经疾病

2019-01-07何梅毛敏赵国燕汤竣杰冯爽鲁秀敏王永堂

中国康复理论与实践 2019年2期

何梅，毛敏，赵国燕，汤竣杰，冯爽，鲁秀敏，王永堂

1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆市400054；2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042

Nogo属于Reticulon(RTN)家族，又称为RTN4。Nogo蛋白有3个亚型，即Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，因选择性剪接或启动子不同而产生，共享相同的羧基端。在3个亚型中，Nogo-A对中枢神经系统(central nervous system,CNS)抑制作用最强。Nogo-A及其受体在中枢神经再生过程中发挥重要作用，还可作为大脑功能和结构稳定性的重要调节因子，在突触可塑性改变过程中发挥关键作用，进而参与相关神经疾病发生的调节[1]。

1 Nogo-A及其结构

Nogo-A是一种相对分子量为256 kDa的髓鞘蛋白，由1192个氨基酸组成，富含酸性氨基酸和脯氨酸。在成年哺乳动物中，Nogo-A主要分布于CNS少突胶质细胞中，在高度塑性CNS区域的神经元，如海马或皮质中也高度表达[2]。Nogo-A含有短-COOH末端、细胞外-NH2末端和两个主要跨膜功能域。C端由188个残基组成，包含两个疏水区和Nogo-66功能域；Nogo-66在两个疏水区之间，包含66个残基，位于内质网腔或细胞膜外。Nogo-A的第二个功能区主要位于N端细胞外域，称作Nogo-A-∆20或amino-Nogo[3]。

RTN蛋白呈不同于传统跨膜蛋白的发夹样。Nogo-A在内质网和质膜中有不同结构，根据疏水片段是否完全跨膜，蛋白质呈“V”或“W”构型。在内质网膜中，-COOH和-NH2末端都位于胞质侧；当Nogo-66位于管腔胞质侧时，Nogo-A呈“V”样；在管腔侧时，则呈“W”样。在质膜中，当Nogo-A呈“V”样时，-COOH末端位于胞质侧，-NH2末端和Nogo-66都位于胞外空间；而当Nogo-A呈“W”样时，-COOH末端位于细胞外侧[4]。

2 Nogo-A受体

Nogo-A对中枢神经再生及突触可塑性影响主要通过其受体实现。Nogo-A受体有Nogo受体(Nogo-66 receptor,NgR)、成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B,PirB)和新发现的鞘氨醇-1-磷酸受体2(sphingosine 1-phosphate receptor 2,S1PR2)。它们分别通过Nogo-A相应的作用位点发挥生物学功能。

NgR位于细胞膜表面，主要在成年动物CNS中表达，能特异性结合Nogo-66结构域，命名为NgR1。NgR1是Nogo蛋白、髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)三种主要神经轴突再生抑制因子的共同受体[5]。Nogo-66与NgR1结合，抑制神经突生长，限制突触可塑性；靶向NgR1治疗被认为是促进轴突再生的潜在策略。新型Nogo-66受体拮抗肽(NgR1 antagonist peptide,NAP2)能促进细胞轴突在生长抑制环境中再生[6]。由于缺乏细胞内信号传导域，NgR1需要与膜蛋白神经营养因子受体p75NTR和/或肿瘤坏死因子受体家族成员TROY以及亮氨酸富集重复蛋白LⅠNGO-1相互作用，形成受体复合体，将信号传导至下游RhoA和Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(RhoA and Rho-associated coiled-coil-forming kinases,RhoA-ROCK)，导致肌动蛋白解聚、肌球蛋白收缩和微管崩解[7]。最近还发现一种新型Nogo-66受体，即PirB，其作用类似于NgR1[8]。

Nogo-A-∆20是Nogo-A N末端区域的另一个结构域。Kempf等[9]发现，S1PR2为Nogo-A-∆20的特异性受体和信号转导子。Nogo-A-∆20与S1PR2结合可激活G蛋白G-13以及白血病相关Rho鸟嘌呤交换因子(leukemia-associated Rho-specific guanine nucleotide exchange factors,LARG)，上调RhoA水平，抑制神经轴突生长或成纤维细胞扩散，同时诱导长时程增强(long-term potentiation,LTP)效应减弱；另一方面下调磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(phosphorylated cAMPresponse-element binding protein,p-CREB)的活性水平。

综上所述，Nogo-A与其不同受体，如NgR1、PirB和S1PR2的相互作用，激活不同信号通路，抑制神经轴突生长。

3 Nogo-A参与突触结构和功能可塑性调节

Nogo-A是最早确定的髓磷脂抑制因子(myelin-associated inhibitors,MAⅠs)，最初发现其主要在中枢神经生长和再生过程中发挥重要作用。最近发现，Nogo-A及其受体NgR1、S1PR2和PirB还在以高可塑性水平为特征的脑区如大脑皮质和海马突触前后表达，提示Nogo-A及其受体可能参与突触可塑性调节[9]。

突触树突棘的生长和收缩以及轴突结构可塑性变化被认为是学习和记忆的基础[10]。功能性和结构性突触可塑性已被证实可作为大脑几个区域学习和记忆的基本机制，包括获得新的运动技能[11]。

在结构上，中和或抑制Nogo-A或NgR1可促进轴突生长，调节树突分支，并在一定程度上增强脊髓组织密度和更新速率。抗体中和Nogo-A可明显促进成年大鼠小脑和脊髓中未受伤轴突的发芽。在体外培养的成熟海马切片中，Nogo-A的失活也导致锥体轴突和树突的生长及分支复杂性增加，敲除NgR1/2/3，CA1海马锥体神经元树突复杂性也有类似增加[12]。通过观察Nogo-A基因敲除或Nogo-A过表达转基因小鼠，发现Nogo-A可负向调节小脑中浦肯野细胞树突的生长和复杂性[13]。上述研究表明，Nogo-A和NgR1决定突触形态的形成和稳定性，而突触后树突棘结构以及轴突长度则由Nogo-A和NgR1信号传导途径来调控。Nogo-A可通过下游RhoA依赖方式调节突触生长，限制体内海马神经元的突触数量[12]。

在分子水平上，结构变化往往伴随着生长相关标记物和转录因子的下调，这表明Nogo-A可通过下调生长相关基因的表达，抑制成人CNS的突触可塑性。Akbik等[14]观察到NgR1突变小鼠在转杆和音调相关恐惧条件反射中，表现出学习能力增强。Nogo-A抗体治疗后，大鼠运动学习能力增强，并有效提高运动皮质中树突棘密度[15]。在视觉和感觉皮质中，Nogo-A及其受体的缺失可维持经验依赖性可塑性。Guzik-Kornacka等[16]使用视动反应(optokinetic response,OKR)和单眼剥夺(monocular deprivation,MD)诱导OKR可塑性，在敲除Nogo-A的成年小鼠中，Nogo-A能限制视觉体验驱动的OKR可塑性。Nogo-A受体PirB负调节视皮质第5层锥体细胞的树突棘密度以及成人眼优势可塑性阈值[17]。

除结构变化外，大脑存储信息还需要持续改变突触传递强度。突触传递强度的长期变化表现为LTP或长时程抑制(longterm depression,LTD)，在海马学习和记忆过程中发挥重要作用，与树突棘的结构修饰相关。Nogo-A及其受体对突触传递强度也有一定抑制。Nogo-A或NgR1抗体中和后，发现电诱导的LTP在数分钟内增强，皮质锥体神经元的树突棘密度在数天内增加[15]。Tews等[18]通过在CA3-CA1区Schaffer侧支路径上使用θ-刺激改变LTP，与野生型相比，Nogo-A敲除大鼠LTP显著增强。NgR1敲除小鼠促进LTP，并导致培养海马切片中LTD减弱，表明NgR1信号传导是突触传递过程中的重要调节因子[19]。突触可塑性的急性调节可能有助于阻断Nogo-A和NgR1，提高CNS损伤后的恢复。

作为糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPⅠ)锚定蛋白，NgR1通过一系列其他共同受体发出信号，与可塑性相关的有p75NTR。p75NTR在海马成熟锥体细胞中负调节树突结构可塑性及LTD的维护，并导致不同信号通路激活[20]。PirB敲除小鼠显示出更高的树突棘密度和稳定性，这些形态学变化与高频率微型突触电流相关，增强LTP，抑制LTD[17]。Nogo-A-∆20特异性受体S1PR2是CNS突触稳定的重要调节因子。急性阻断Nogo-A/S1PR2信号传导，海马和皮质突触可塑性增强；药物阻断S1PR2后，LTP的增强更加明显[9]。

Nogo-A在功能性突触可塑性中起重要作用，是突触可塑性和运动皮质学习有影响力的分子调节剂。Zemmar等[15]研究Nogo-A在新皮质活动依赖性突触可塑性中的作用，以及在成人和未受伤啮齿动物运动皮质运动学习任务中的作用。经Nogo-A抗体治疗后，学习精确运动的能力增强；在海马切片中加入可溶性Nogo-66或OMgp，可抑制LTP，增强LTD[21]。Nogo-A-∆20在内吞入神经突后，逆向运输到胞体中，引发RhoA活化并下调p-CREB活性[22]。推测Nogo-A很有可能使用类似的信号减少生长因子信号传导的影响，抑制生长因子的转录水平，进而参与突触可塑性调节。

4 Nogo-A与神经疾病

CNS再生障碍以及运动学习机理相当复杂，树突结构和树突棘的数量和形状影响神经元的功能，并与活动依赖性过程如突触可塑性相关。越来越多的实验表明，膜蛋白Nogo-A是网络稳定分子中重要候选因子，在许多CNS相关疾病中发挥重要作用。

4.1 脊髓损伤

Nogo-A蛋白抑制神经细胞轴突生长并导致细胞生长锥塌陷，是影响脊髓损伤后神经再生修复的重要因素。敲除Nogo-A或使用Nogo-A和NgR抗体，对急性CNS损伤动物模型的轴突再生和功能恢复有明显疗效。抑制NgR1在脑外伤中也显示出认知功能的改善[23-24]。

Nogo-A对脊髓损伤的影响最终通过下游RhoA-ROCK信号通路实现。Rho激酶参与细胞及组织损伤，抑制Rho-ROCK通路可促进原代神经元或脊髓损伤模型的轴突生长[25]。从轴突生长抑制因子到生长锥肌动蛋白细胞骨架的信号传导过程都有RhoA-ROCK通路的参与，使细胞骨架肌动蛋白变得不稳定，最终导致生长锥塌陷，干扰轴突再生[1]。阻断RhoA-ROCK信号通路可以很好地刺激脊髓或视神经损伤后轴突发芽和再生，更好、更快地恢复不同的脊髓损伤模型功能性运动[26]。Nogo-A及所引导的下游信号通路是脊髓损伤潜在的治疗靶点。

4.2 多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)

MS是CNS中常见的炎症性疾病。其确切发病机制尚不清楚，灰质和白质的进行性退化是该病的标志，脱髓鞘是神经退行性过程的重要组成部分，并伴有髓鞘和轴突损伤[27]。Nogo-A在急性和慢性MS病变周围的髓鞘和髓鞘碎片中大量存在，并限制轴突再生和髓鞘修复，可能是MS的潜在治疗靶标。最近还发现，Nogo-A及其受体与实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的进展有关，Nogo-A抗体中和或基因敲除在EAE和MS模型的轴突变性中发挥作用[28]。成人CNS具有神经修复和损伤后可塑性的潜在能力，但是受生长抑制因子如Nogo-A的限制。Yang等[29]运用小干扰RNA在体内外特异性抑制Nogo-A的表达，促进了轴突修复，并对EAE有改善作用。Ⅰneichen等[30]在成年大鼠颈脊髓背侧诱导EAE病变，导致前肢运动功能下降；抗Nogo-A治疗后前肢运动功能得到改善。NgR1敲除可改变塌陷反应介质蛋白-2(collapsing response mediator protein-2,CRMP-2)的磷酸化状态，从而阻断Nogo-A下游信号传导途径，有助于MS恢复[28]。NgR1的共同受体LⅠNGO-1基因敲除或抗体拮抗治疗也可阻断轴突变性，促进EAE小鼠髓鞘再生和功能恢复[31]。抗Nogo-A抗体治疗有望作为MS的潜在疗法，特别是慢性期，当神经变性和髓鞘再生失败时有重要的应用前景。

4.3 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)

Nogo-A还参与AD的发生发展。Gil等[32]发现，Nogo-A在正常老年人海马少突胶质细胞和神经元中表达，但在AD患者海马神经元中过度表达，并与β-淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)相关。Zhou等[33]发现，Nogo-A及其受体蛋白家族可通过与淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的相互作用，调节Aβ产生。NgR1在抑制轴突再生中起重要作用，并可通过影响APP代谢参与AD的病理过程。在AD患者海马CA1和CA2区，NgR1免疫阳性神经元与神经元总数的比值高于正常老年人[34]。PirB也参与Aβ调节。Kim等[35]发现，存在于人脑中的鼠PirB及其人类同源性白细胞免疫球蛋白样受体B2(leukocyte immunoglobulin-like receptor B2,LilrB2)均是具有纳摩尔亲和力的Aβ寡聚体受体。与Aβ单体相比，Aβ寡聚体对PirB具有更高的结合力，PirB与Aβ寡聚体的协同作用，导致海马损伤，并最终形成AD。阻断Aβ寡聚体和LilrB2之间的相互作用可能是AD治疗的潜在策略。

S1PR2也参与AD发生。S1PR2被认为是成人CNS中突触稳定的重要调节因子。用Aβ处理培养的海马神经元，能导致cAMP/PKA/CREB信号传导途径失活并抑制LTP[36]。Nogo-A-∆20可诱导p-CREB水平降低，可能加剧Aβ对LTP的抑制作用。

Nogo-A及其受体参与AD的患病机制研究得还不够深入，将Nogo相关药物用于AD的临床治疗可能还不够成熟。

4.4 创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder,PTSD)

PTSD是指在遭遇或对抗重大压力或威胁后，心理状态失调，导致个体延迟出现或长期持续存在精神障碍。PTSD最显著的特征是创伤性记忆持久存在并易于激活、持续性警觉增高，这种恐惧和学习记忆是通过改变突触效能实现的，突触可塑性参与对恐惧记忆的维持和恐惧条件反射的表达[37-38]。海马区与空间学习记忆、认知情感和恐惧形成密切相关，LTP和LTD则为某些记忆活动的神经生物学基础，共同组成学习记忆神经网络系统。海马CA1的LTD增强还与PTSD的共病，如精神分裂症、抑郁症和情绪障碍有关[39]。采用连续单一刺激(single-prolonged stress,SPS)制备的PTSD小鼠，海马LTD和LTP均有不同程度增强；阻断海马LTP可有效抑制其逆向学习能力[40]。Nogo-A及其受体NgR、PirB、S1PR2参与海马突触可塑性调节，而异常的突触可塑性是PTSD发生的潜在机制。敲除NgR1及其配体MAⅠs，如Nogo-A和MAG，均可有效抑制恐惧记忆[41]。提示Nogo-A及其受体可能参与PTSD的调控过程。