解析植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法

2019-01-07薛棪

福建茶叶 2019年12期

关键词：褐变酚类外植体

薛棪

（荆楚理工学院，湖北荆门 448000）

引言

褐变现象对植物的生长具有极大危害，是植物组织培养实践中的重难点问题。据此，为了提升植物组织培养的顺利运行，降低植物体因褐变现象而衰弱或死亡的情况发生，我们有必要对植物组织培养中褐变现象的产生机理与客服方法进行讨论解析。

1 植物组织培养中褐变现象的产生机理

植物组织的褐变现象可由产生机制的差异分为非酶促褐变与酶促褐变两种。其中，所谓“非酶促褐变”，即没有酚类底物的干预，植物体本身由于缺水、衰老、寒冷等原因而发生的细胞死亡，如苹果因过度成熟而形成褐变、荔枝因失水pH值持续上升而形成的褐变等。所谓“酶促褐变”，即在酚类底物的干预之下，经过酶催化而引发的褐变，此类褐变现象在植物组织培养中出现的几率较高。从产生机理来看，酶促褐变的出现与酶、酚类底物、氧气三个要素息息相关。经业内长期的研究与实践发现，引起植物组织褐变现象的酶主要有多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶以及过氧化物酶三种，其中尤以多酚氧化酶最为常见。引起植物组织褐变现象的酚类底物主要有苯基羧酸、苯丙烷衍生物以及黄烷衍生物三种。

若植物组织处在健康的生长状态时，即便其体内同时存在酶、酚类底物与氧气，通常也不会出现褐变现象。究其原因，主要是酶与酚类底物分布区域不同，前者多处在细胞的液泡中，而酚类底物则处在细胞质及细胞间质中。但植物组织健康的细胞结构被打破、细胞膜出现破损时，酶与酚类底物便保有了接触的条件，进而在氧气的催化作用下形成醌，导致细胞出现脱水、聚合等异常反应，最终生成黑褐色的病变物质，引发植物组织的褐变现象。此外，经相关学者对金花梨、苍溪梨等植物的研究发现，褐变现象的出现几率、发生程度存在一定规律性，与酶的活性和酚类底物的含量相关[2]。

2 植物组织培养中褐变现象产生的影响因素

2.1 植物本身的影响

第一，植物的类别及品种的影响。与草本植物相比，木本植物更容易发生褐变现象。经周俊辉等学者的专项研究表明，宽皮桔、东北红豆杉、牡丹、荔枝、苹果、银杏、猕猴桃等木本植物的褐变现象较为普遍。木本植物之所以更容易发生褐变现象，主要是因为其细胞中木质素、单宁等酚类底物的含量较高。此外，在进行柑橘属木本植物的培养研究中发现，宽皮桔的褐变现象最为严重，葡萄柚、橘橙辞职，甜橙的褐变程度相对较轻。由此可见，在同一类别之下，不同品种植物的褐变程度存在很大不同。究其原因，应是受到不同品种植物细胞组织中酚含量的差异影响。

第二，植物体积及破坏程度的影响。通常来讲，植物的体积越小，其细胞结构越密集，褐变现象的发生几率也就越大。反之，植物的体积越大，其细胞破坏后酶与酚类底物越难接触，褐变现象的发生几率也就越小。同时，经实践研究表明，培养中植物体的切口面积也会对褐变现象产生影响。例如，当金冠苹果的切削口径处在0.5毫米以下时，其褐变现象最为严重，且较已易引起苹果的局部失活或整体死亡；当金冠苹果的切削口径处在5毫米至15毫米的区间内时，其褐变现象的发生几率最低，且褐变后的死亡率也降至10%左右。但从既往经验来看，这一规律并不是普适的。例如，桉树叶片的切削面积越大，其酚类底物的产生数量越多，褐变现象也就越严重。

第三，植物生长状态的影响。通常情况下，酶与酚类底物两大褐变要素会随着植物体的生理变化而变化，当植物年龄增长、木质化加剧时，其内部的酶与酚类底物含量也会随之升高。因此，幼龄期植物的褐变程度往往最轻，这一点也在山核桃、桉树等植物的培养研究中得到了有力证实。同时，相关人员在采集培养所需的植物材料时，所选时节的不同也会影响到植物后续的褐变程度。一般来讲，夏季的环境气温较高、光照充足，植物的代谢活动旺盛、光合作用较强，其细胞中酶的活性也有所升高。若在此时采集植物材料，褐变现象的发生几率将显著增加。相比之下，秋冬季节的气温较低，空气也相对干燥，因此植物大多代谢缓慢，甚至处在半休眠的状态当中。若相关人员选择此时作为植物材料的采集时期，由于植物细胞中酶的活性较低，褐变现象的发生几率也会随之减小。

2.2 植物处理方式的影响

在正式进行植物组织的培养之前，相关人员还需对植物体进行水培、消毒等预处理手段，也会对植物后续的褐变几率产生影响。通常来讲，植物的水培时间越长，其褐变几率越低。同时，先采用流动水冲洗植物，再进行5℃左右的低温处理，从而降低植物细胞的活性，也能达到降低褐变几率的预处理效果。此外，相关人员在对植物材料进行消毒时，也应遵循科学适度的处理原则。一方面，氯化汞对植物体的伤害较轻，褐变几率也较低；乙醇的灭菌效果较强，但对植物体的伤害较大，褐变现象也较容易发生。因此，相关人员应结合具体的培养需求，实施出正确的消毒剂选择策略。另一方面，植物的消毒时间越长，其褐变的发生几率也越高。所以，相关人员还应对消毒处理的时间进行合理控制，以确保植物的健康生长。

2.3 植物培养环境的影响

培养基作为植物培养生长的重要基础，其基质种类、营养成分的不同也会对植物褐变现象产生差异影响。当培养基中的无机盐浓度过高时，植物体内的酚类底物会从细胞间质中溢出，继而与酶充分接触，引发褐变现象。因此，通过降低培养基中亚铁离子、亚铜离子等离子的浓度，能有效防止酚类底物的外溢，避免酚类底物与酶接触发生氧化，从而将褐变现象的发生几率控制在较低水平。同时，不同植物种类对培养基的适应能力也各不相同。经研究显示，核桃、樱花、苹果等植物在1/2MS与1/2DKW两种培养基中的褐变控制效果最好，银杏、红豆杉等植物在MS培养基中的褐变控制效果最好。

其次，在植物组织培养的过程中，做好基质的选择也是极有必要的。从褐变现象的预防角度来看，纸桥法为最佳，液体培养法次之，半固体培养法再次，固体基质的预防效果最差。究其原因，主要是纸桥法的滤纸结构可实现毒害物质的渗透吸取，进而达到清洁培养环境、减轻褐变危害的效果；液体基质可实现毒害物质的外化扩散，从而缓解褐变现象的集中形成，也能达成较好的褐变减轻目的；半固体基质多以低浓度的琼脂为主，其虽然也能保有类似液体基质的毒害物质扩散能力，但由于动性较差，褐变减轻效果并不理想；固体基质则无法完成毒害物质由植物体向外部环境的有效导出，因此很难对褐变现象起到控制作用。

最后，上文提到，季节变化可对植物体内酶的活性产生影响，控制植物组织培养环境的温度也可达到此类效果。一般来说，温度处在较低水平时，褐变现象能得到显著减轻。例如，当板栗的培育温度降至19℃时，其褐变程度明显缓解；当无花果的培育温度降至10℃时，其褐变几率最低。因此，相关人员在不影响植物健康生长的基础上，可进行培养环境温度的适当调低。与之相似，经桉树外植体全光照与无光照的比对培养试验发现，10个试验日内全光照下的桉树褐变几率明显增高，而无光照下的桉树则正相反。由此可见，通过调节光照条件、适当抑制植物的光合作用，也能起到减缓植物代谢、降低褐变几率的效果。因此，相关人员在植物组织培养的实践当中，也可适当应用暗处理的褐变预防手段。

3 植物组织培养中褐变现象的克服方法

3.1 做好植物材料的科学选择

上文提到，植物材料的成长状态、采集时间都会对褐变现象的发生几率产生影响。因此，相关人员在选择和采集外植体进行植物组织培养时，应尽量选择幼龄期的植株，并将采集时间避开夏季。同时，基于自然生长规律，植物在冬天往往处在深度休眠当中，生长能力较弱，故而存在较大的采集难度。所以，在早春或深秋进行外植体采集为宜。除此之外，由于同一类型下不同品种植物的褐变程度也有所差异，因此相关人员在采集时还应注意植物的基因特点，选择出褐变程度较小、褐变几率较低的植物品种作为外植体。

3.2 实施合理的植物预处理手段

酶与酚类底物在氧的催化作用下生成醌，这类物质是植物体发生褐变现象的毒害元凶。在进行植物组织培养的过程中，相关人员可通过科学的预处理手法，降低醌类物质的毒害作用与生成能力。首先，应将外植体进行流水冲洗，再将其置于2℃至5℃的环境中低温处理12小时至24小时，从而减缓植物的代谢，降低细胞内酶的活性。其后，再应用氯化汞或70%浓度的乙醇对外植体进行消毒，将其接种在仅含蔗糖的半固体培养基中培养5天至7天，以便将植物组织中的酚类底物渗透到琼脂当中。若一周后仍有酚类底物渗出，则还需进行2至3次培养基转移。最后，当酚类物质显著减少时，便可将外植体接种到适宜的培养基当中。这样一来，在促进外植体切口愈合的同时，能达到理想的褐变现象减轻目的[2]。

3.3 优化植物培养的环境条件

首先，应基于植物组织培养的技术条件，按照纸桥培养、液体培养、半固体培养、固体培养的次序选择培养基质，并结合外植体品种对培养基的MS、WPM、B5等具体类型进行科学选择，控制好培养基中蔗糖、无机盐、离子的成分浓度。其次，由于温度会对植物的褐变程度与褐变几率产生影响，所以相关人员应保证培养环境温度不宜过高。最后，在外植体的培养初期，可在无光照或弱光照的暗处理条件下进行，以便降低植物细胞中酶的活性，有效规避褐变现象的产生。

3.4 在培养基质中适当添加抗褐变剂

当合理实施上述措施后，仍然无法达成高水平的褐变现象客服效果时，相关人员而通过添加抗褐变剂的方式，对植物组织培养条件进行人工改良。从当前来看，业内常用的抗褐变剂主要有吸附剂、抗氧化剂两类。其中，吸附剂主要以活性炭为主，可在氢键与分子的相互作用下实现周围物质的有效吸附。但需要注意的是，由于活性炭的吸附缺乏选择性，其在吸附毒害物质的同时，也会吸附培养基中的营养成分，进而与外植体形成一定的竞争效应。对此，相关人员在应用活性炭时，可适当提高培养基内营养物质的浓度，以便保证植株的健康生长。据有关研究显示，在应用活性炭后，植物褐变现象的产生几率可降低22%左右。抗氧化剂有柠檬酸、硝酸银、植酸、二硫苏糖醇等多种类型，可对植物细胞内酚类底物的氧化效应形成抑制作用，从而降低醌类毒害物质的生成，达到阻抗褐变现象的效果。需要注意的是，不同类型、不同浓度的氧化剂对不同植物材料的作用能力也存在一定差异。例如，对于葡萄的愈伤组织来说，浓度为20克每升的甘露醇溶液应用效果最好，浓度为0.02克每升的硝酸银溶液次之；对于牡丹来说，浓度为2.0毫克每升的硝酸银溶液应用效果最好。