黄仕美

【摘 要】目的：观察海洛因依赖大鼠海马CA1区磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表达变化及相互关系，以探讨神经元内易聚蛋白磷酸化Tau、α-Synuclein与海洛因致神经元损伤的关系。方法：建立海洛因成瘾大鼠模型，SD大鼠随机分为短时组2w、长时组4w及对照组。采用免疫组织化学方法，显示海洛因依赖大鼠海马CA1区磷酸化Tau、α-Synuclein的表达变化。结果：海洛因依赖大鼠海马CA1区中磷酸化Tau、α-Synuclein的表达均较对照组显著升高，长时组高于短时组（P<0.05）。海洛因依赖组中磷酸化Tau与α-Synuclein的表达水平呈正相关（r=0.436，p<0.05）。结论：海洛因中毒可引起神经元内磷酸化Tau蛋白、α-Synuclein异常聚集。

【关键词】海洛因;磷酸化Tau;α-Synuclein;海马CA1

阿片类毒品对人类的危害被社会各界广泛关注，海洛因依赖者比例有逐年升高的趋势[1]。大量研究表明，海洛因依赖可导致广泛神经元变性坏死、萎缩退化及脱髓鞘改变，且海洛因依赖被认为是一种与记忆、痴呆症相关的慢性、复发性神经变性疾病[2]。我们前期研究也发现，海洛因依赖大鼠额叶、海马区均出现神经元数量减少、神经元变性、嗜神经现象等形态学改变。

大多数神经变性疾病共同病理特征是神经元内存在易聚集蛋白，如Tau 蛋白、突变的α-突触核蛋白（α-synuclein）、淀粉样前体蛋白、Huntingtin蛋白等，它们对神经元产生毒性作用，最终导致神经元的死亡而出现相应的临床症状[3]。国内外对于海洛因成瘾及复吸所引起的神经损害是否也与易聚集蛋白的毒性作用有关尚未见报道。本文通过研究海洛因依赖大鼠海马CA1区磷酸化Tau蛋白、α-Synuclein表达水平的变化，探讨海洛因依赖脑损伤机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康SD大鼠30只，购自贵州医科大学实验动物中心。3月龄，体重200-220g，雌雄各半。

1.1.2 药品和试剂

海洛因由贵州省公安厅提供。磷酸化Tau蛋白（Rabbit Anti-P-Tau protein）购自北京博奥森;α-核突触蛋白（α-Synuclein）购自Santa公司;生物素化二抗（山羊抗兔IgG、鼠抗兔IgG）购自北京博奥森公司，其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物模型

经过适应性喂养一周后，按体重及性别随机分为3组，每组10只，长时组（皮下注射海洛因4w），短时组（皮下注射海洛因2w），正常对照组（皮下注射等量生理盐水），饲养期分别为2周和4周，参照以往文献成功复制海洛因依赖模型的方法，给予SD大鼠海洛因皮下注射，首日每次剂量3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg递增海洛因注射量，连续9天（第9天每次剂量达27mg/kg）。对照组按同样方式注射等量生理盐水。每天观察动物生长发育状况及体重变化情况。第10天用5 .0 mg/kg纳洛酮腹腔注射，诱发戒断症状观察30min，对海洛因成瘾大鼠模型戒断症状进行评分，确认海洛因依赖模型成功。短时组继续皮下注射27mg/kg海洛因4天（共计2周），每天2次;长时组继续皮下注射27mg/kg海洛因18天（共计4周），每天2次。生理盐水对照组各5只大鼠分别采用与模型组相同剂量的生理盐水注射2周、4周。

1.2.2 动物行为变化观察

观察大鼠毛色、饮食、活动情况、精神状态，用电子秤称量大鼠体重。参照Seebers等评分标准，进行大鼠催促戒断症状评分。

1.2.3 取材和标本制备

各组大鼠分别用戊巴比妥腹腔注射麻醉，灌注4%的甲醛溶液固定，参照鼠脑立体定位图譜冠状取海马CA1区脑组织（包含周边组织）。

1.2.4 免疫组织化学Envision法

切片常规脱蜡至水，0.01mol/L枸缘酸钠缓冲溶液（PH6.0）微波抗原修复，蒸馏水洗2min，PBS冲洗3次，5min/次，3%H2O2室温避光孵育10分钟，除去内源性过氧化氢酶，蒸馏水洗2min，PBS冲洗3次，5min/次，胰酶（1：1稀释）37℃恒温箱中消化20min，使抗原位点暴露，蒸馏水洗2min，PBS冲洗3次，5min/次，分别滴加一抗磷酸化Tau蛋白、α--Synuclein （用PBS稀释1：100、1：100），4℃冰箱孵育过夜，复温，PBS冲洗3次，5min/次，磷酸化Tau蛋白滴加兔二抗IgG（PV6001），α--Synuclein滴加鼠二抗IgG（PV6002），37℃孵育30min，PBS冲洗3次，5min/次，DAB液显色，苏木精轻度复染，常规脱水、透明、封片。

1.2.5 图像分析

通过Biomias 2000 图像分析系统进行计算分析，具有阳性表达的区域随机选取4个视野，每个视野随机选取阳性表达部位进行平均灰度值测定，平均灰度高则表达强，反之则弱。

1.3 统计方法

运用SPSS 19.0统计软件数据包进行数据分析，用均数±标准差（D）表示，两组间的比较采用独立样本T检验的分析方法;相关性分析采用Pearson直线相关分析法。相关系数采用r表示，以P<0.05表示与对照组相比差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组相关蛋白表达比较（见表1）

异常磷酸化Tau蛋白阳性表达存在于海马神经元胞质和轴突中，以轴突最为明显;α-Synuclein蛋白主要集中在海马神经元核周胞质及突触终末;细胞外均未见表达。免疫组织化学定量分析，磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表达水平为：长时组>短时组>对照组，统计有显著差异，P<0.05。

2.2 大鼠脑组织中磷酸化Tau蛋白与α-Synuclein的关系

海洛因依赖大鼠海马CA1区磷酸化Tau水平与相应时程用药组的α-Synuclein蛋白水平呈正相关（0

3 讨论

海洛因是成瘾性极强的吗啡衍生物，它由吗啡经乙酰化制成，具有较吗啡更大的脂溶性，更易于通过血脑屏障以及对脑奖赏性刺激。研究发现[4]，产生成瘾和复吸行为的中枢主要在中脑边缘系统。这个体系与动机、奖赏、心理强化等心理形成有关，中脑边缘系统中的海马、前额叶皮质是空间学习记忆的核心中枢， 多年来已成为研究学习与记忆机制的重要解剖结构。临床和动物试验均发现海洛因成瘾可引起海马缺氧缺血病理损害，而大鼠背侧海马CA1区对缺氧缺血更加敏感[5]。可见海马CA1区是学习记忆的核心中枢，在以记忆、痴呆相关的神经变性疾病（如AD、海洛因成瘾等）中，易产生神经元变性、缺失而出现明显病理学改变。我们前期研究发现，海洛因依赖成瘾可致额叶、海马区脑组织的泛素活化酶1（ubiquitin-activating enzyme 1，UbE1）表达量减少，且泛素化水平降低，推测泛素蛋白酶体系功能紊乱可能是海洛因对大鼠成瘾复吸或脑组织损害的原因之一。而泛素蛋白酶体系统具有识别磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白等多余的和错误折叠的蛋白质，以保持细胞内蛋白质平衡的作用。因此，本研究通过检测海洛因依赖大鼠海马CA1区磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表达变化及相互关系，探讨易聚蛋白与海洛因致神经元损伤的关系。

Tau蛋白是一种神经元微管相关细胞骨架蛋白，正常情况下广泛存在于神经元内，轴突含量很高。异常磷酸化可以引起Tau蛋白错误折叠，形成配对螺旋样二聚体（paired helical filaments，PHFs），是神经原纤维缠结的主要成份，具有减弱顺向轴浆运输等作用，对神经细胞的正常功能产生不利的影响。以往研究还发现[2，5]，海洛因成瘾复吸大鼠光镜、电镜观察脑内结构见轴突、树突中神经微管和神经微丝崩解。在轴突中，含量最高的微管相关蛋白是Tau蛋白，其功能由磷酸化状态调节，过度磷酸化的Tau蛋白丧失了促进微管组装的活性，使微管组装降低，最终导致神经元退行性变。最具代表性的神经元退行性变的疾病是人类的阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）。我们通过免疫组织化学法检测发现，异常磷酸化Tau蛋白广泛定位于大脑皮质及海马神经元胞质和轴突中，以轴突最为明显，细胞外未见表达，异常磷酸化Tau蛋白阳性表达在各组的表达水平为：长时组>短时组>对照组，统计有显著差异，P<0.05。α-Synuclein蛋白是一种前突触蛋白，主要在神经组织中表达，是淀粉样蛋白斑块（NAC）的前体蛋白（NACP）。α-Synuclein蛋白异常聚集也可以引起神经组织退化疾病，如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、路易体痴呆等。研究还表明，Tau蛋白、微管蛋白、A-β肽等蛋白质能促进α-Synuclein蛋白的异常聚集[6]。因此，本次实验同时检测了α-Synuclein蛋白表达，在海洛因依赖大鼠海马CA1区，α-Synuclein蛋白出现了与异常磷酸化Tau阳性相似的阳性表达，即：长时组>短時组>对照组，统计有显著差异，P<0.05。

本研究结果显示，海洛因依赖大鼠海马CA1区的磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白水平均显著下降，且随药物依赖时间递增，表明磷酸化Tau蛋白的异常聚集可能诱发了α-Synuclein蛋白的异常聚集。同时，二者蛋白表达呈正相关，提示二者可能协同参与了海洛因成瘾复吸或脑损伤机制，其异常聚集打破了泛素蛋白酶降解体系的调节平衡，使错误折叠蛋白异常聚集，引起神经元一系列退行性变，最终造成海洛因依赖脑组织受损和功能障碍。

参考文献

[1]胡赟，梁文妹，李一欣等.海洛因依赖大鼠颌下腺IL-1、TNF表达的改变[J]，实验动物科学，2017，34（6）：1-5.

[2]蔡兴慧，宋小鸽，张荣军.针刺对海洛因复吸大鼠脑神经元超微结构变化的影响[J].中国药物依赖性杂志，2012，21（1）：26-29.

[3]刘英华，罗健东.蛋白酶体活性抑制对大鼠海马tau蛋白的泛素化影响[J].实用医学杂志，2011，27（3）：386-389.

[4]俞发荣，李建军，俞鑫等.干预措施对精神依赖药物成瘾生理生化机制的影响[J].中国实验动物学报，2018，26（6）：799-803.

[5]邝满元，邓鹏程，徐松.吗啡成瘾戒断对大鼠海马CA1 区P-CREB表达的影响[J].解剖学研究，2009，31（1）：50-53.

[6]焦璐琰.α-核突触蛋白（α-Synuclein）和Tau相互作用的研究进展[J].解剖学研究，2016，38 （2）：143-147.