宗 航， 田博文， 张 瑞， 赖振雨， 周子惠， 吴 菲， 雷初朝， 党瑞华

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

高等动物的配子体外发生技术的研究进程较为缓慢，主要有两方面原因。首先，相对于各组织均可再生的后生动物门，哺乳动物及鸟类，尤其人类的再生受到严重限制甚至缺乏再生能力，不同组织器官的再生能力差异也十分显著[1]。其次，配子发生过程经历在多个不同的组织结构中，发育的时间亦有间隔性，且存在有丝分裂以及减数分裂的2个分裂过程，细胞内的表达调控通路多且复杂，参与调控的物质多，视黄酸(retinoid acid，RA)、孕酮、类无精症缺失基因(deleted in azoospermia-like gene，Dazl)编码的RNA结合蛋白等物质均参与了减数分裂的调控[2-7]。自Odor等[8]证明可以通过培养小块卵巢在体外产生大量卵母细胞以来，近期该研究领域取得了重大进展。Hikabe等[9]通过加入卵巢细胞等的方法，在30 d内通过对成纤维细胞衍生的多潜能干细胞培养，产生了具有受精能力的小鼠卵母细胞。本文将论述近期配子体外发生技术的进展及其广泛的应用前景。

1 配子体内发生过程

配子发生需要经过几个严格的步骤，包括原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的形成、增殖，迁移到生殖嵴，分化成成熟的配子几个过程[10]。

1.1 原始生殖细胞的形成、增殖与迁移

在胚外组织细胞分泌的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)胞外信号分子诱导下，原始生殖细胞首先在早期胚胎的上胚层中形成[11-12]，经有丝分裂后，数目增加并聚集于胚外中胚层和内胚层附近的原条中。在此期间BMP蛋白家族及无翼型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点蛋白家族(wingless-type mouse mammary tumor virus integration site family member，WNT)与PGCs表面受体结合，激活细胞内通路，维持PGCs的多能性[13-14]。小鼠PGCs的迁移起始于8日胎龄时，生殖嵴分泌干细胞衍生因子Ⅰ(stromal cell-derived factor1，SDF1)与PGCs细胞表面趋化因子受体Ⅳ(chemokine receptor type4，CXCR4)结合，后肠分泌干细胞生长因子(stem cell growth factor，SCF)与PGCs细胞表面干细胞生长因子受体(KIT receptor，c-kit)结合，共同趋化PGCs迁移至生殖嵴[15-17]。

1.2 配子细胞的分化与成熟

PGCs定植于性腺嵴后，经过一段时间快速的有丝分裂，使数目大量增加[18]，快速进入下一阶段。与生殖嵴紧密相连的中肾细胞立即分泌RA。对于雄性个体，PGCs上调细胞色素P450家族成员26B1重组蛋白(cytochrome P450，family 26，member B1，CYP26B1)表达，抑制RA的积累[19]。进而抑制RA下游视黄酸诱导基因8(stimulated by retinoic acid gene，Stra8)表达，Stra8基因是减数分裂过程关键表达基因[20]，因而雄性生殖细胞分化停止。直至雄性个体性成熟后，生殖细胞合成视黄酸受体(retinoic acid receptor，RAR)，连续完成减数分裂全过程形成成熟精子。对于雌性个体，RA在细胞内的积累会激活Stra8基因，开始减数分裂，并停止于减数第1次分裂前期。性成熟后，雌性生殖细胞继续减数分裂，并停止于减数第2次分裂中期，直到受精后完成分裂全过程[21]。

2 配子体外发生技术

配子体外发生过程可以分为3个部分：体外分化期、体外生长期、体外成熟期。体外分化即通过培养多潜能干细胞，诱导其在体外定向分化、形成初级卵母或精母细胞的过程。体外生长是配子在体外完成完整的减数分裂过程。体外成熟是指已受精的卵细胞在体外的早期培养并正常发生卵裂过程，以及完成减数分裂的精细胞体外变形成精子的过程。

2.1 配子的体外分化

初级卵母细胞或精母细胞可以分离胚胎期的干细胞经分化后产生，如胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)、外胚层干细胞(epiblast stem cells，EpiSCs)、PGCs等，也可以通过成体干细胞(Adult Stem Cell，ASCs)的诱导分化产生。Hübner等[22]通过体外培养首次证明了ESCs体外具有形成卵母细胞的能力，并在培养基中形成了类似的卵泡结构，但具有很大的随机性。Nayernia等[23]使用RA诱导，使成年小鼠骨髓干细胞成功分化精细胞，表明成体干细胞具有分化成生殖细胞的潜能，但试验中仍存在部分细胞减数分裂停滞的现象。早期研究中的配子体外分化过程主要基于胚胎干细胞随机分化后极少数的生殖相关干细胞的筛选，因而产生配子效率低，不易产生成活且健康的后代。

在之后的研究中，主要通过体外外胚层环境的构建、关键化学物质的诱导定向产生功能性的生殖相关干细胞。Nicholas等[24]在胚胎干细胞的培养基中加入RA、BMP4、SCF等物质成功诱导分化形成初级卵母细胞，并导入至小鼠卵巢中发育成熟。Hayashi等[25]从6.5日胎龄的小鼠胚胎外胚层中分离EpiSCs，使用BMP4诱导分化形成PGCs，并与12.5日胎龄胚胎提取的雌性性腺共同培养。虽然成功分化形成类似的卵母细胞，但效率较低，卵母细胞不易成活。Hayashi等[26]从3.5日胎龄的小鼠胚胎中提取胚胎干细胞，在培养基中加入MEK抑制剂(PD325901)、GSK3抑制剂(CT99021)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)诱导形成类似的外胚层干细胞，构建形成PGCs的外部环境，并在形成的第2天加入BMP4、SCF、LIF诱导分化形成PGCs[27]，导入缺乏内源性生殖细胞的小鼠曲细精管中，成功产生精子，受精后成功产下健康后代。

在最新的研究中，Hikabe等[9]利用小鼠皮肤细胞、尾细胞中含有的ASCs，诱导分化成ESCs，采用Hayashi等[27]的方法诱导形成初级卵母细胞，并与卵巢体细胞混合，重构为“卵巢”，并将重构的卵巢置于涂覆有胶原蛋白的培养基中培养，产生了大量具有卵泡结构的卵母细胞。该步骤是本试验中创新性一步，通过卵巢细胞混合培养，提供卵母细胞分化精细的外部环境，进而实现了从有丝分裂到减数分裂复杂分裂过程的跨越，最终实现了卵母细胞的体外成熟，体外完整的配子发育过程。早在先前的研究中，已经证明PGCs与卵巢体细胞的组合可以在功能上形成重建的性腺，进而形成初级卵母细胞。移植体内后，可完成配子发育的全过程[24,28-29]。Morohaku等[30]也通过卵巢细胞和卵母细胞的混合培养实现了卵母细胞的体外成熟。

2.2 配子的体外生长

大量的试验证明，体外培养形成的初级卵母细胞跨越减数分裂过程是十分困难的[2,29,31]，而颗粒细胞的形成、卵泡的构建也被认为是卵母细胞形成的必要条件[3]。Eppig等[32]认为卵母细胞的成功构建关键在于维持颗粒细胞和卵母细胞间的信息交流，而颗粒细胞在调节卵母细胞发育中的作用取决于颗粒细胞的分化阶段。因此，减数分裂及卵泡的成功构建是卵母细胞在体外生长中关键的两步，其中雌激素等化学物质起关键性作用。Kezele等[33]认为雌激素在卵泡形成中存在抑制作用。Chen等[34]证明了雌激素通过细胞表面受体抑制卵母细胞囊肿的分解和卵泡的构建。Lees-Murdock等[4]发现SCF能够促进卵泡的组装，但不能使卵母细胞发育到次级卵母细胞。

Zhang等[7]通过将收集的小鼠PGCs细胞培养在前腔期颗粒细胞上，形成成熟的卵母细胞并受精，培养至桑葚胚阶段。Zhang等[35]将新生小鼠睾丸细胞(初级精母细胞时期)注射于裸鼠背部，形成了睾丸组织及精子的发生，产生了可育后代。Hikabe等[9]将该技术改进，又在培养基中加入了聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)以及雌激素受体抑制剂(oestrogen inhibitor，ICI)。PVP是一类具有优秀生理相容性和以及溶解性能的高分子化合物，可以在培养基中提供较大的胶体渗透压[36-37]。Hikabe等[9]实验表明PVP可以维持卵母细胞、颗粒细胞复合体的稳定性，促进颗粒细胞的增殖。配子在体内生长发育过程中会受到激素的严密调控。同样，在体外的条件下经激素的严格调控，配子才能实现完整的发育过程。在培养过程中加入雌激素抑制剂，降低培养基中由颗粒细胞产生的雌激素的浓度，才能使卵母细胞正常分裂且卵泡成功组装[33-34]。

而对于精母细胞，由于其减数分裂是连续的进程，体外过程更为容易实现。Zhou等[38]将PGCs与新生小鼠睾丸细胞在RA、BMP蛋白家族存在的条件下共培养，在第6天添加卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone，FSH)，在第14天便完成减数分裂产生精子细胞，将精子细胞注入减Ⅱ中期卵母细胞，成功受精并产下后代。

2.3 配子的体外成熟

哺乳动物卵母细胞的体外成熟过程，早在1959年已经实现[39]。而Steptoe等[40]最早应用于人类，“试管婴儿”就是其较为成熟的应用。但这只是发育十分成熟的卵母细胞的体外培养，而对于较早阶段的卵母细胞，虽已在很多哺乳动物中实现，但人类中还未成功受精并产下健康后代。造成这种情况的原因包括：人类卵子发生过程的持续时间长达数月，在延长期内维持人类卵母细胞的生存能力的困难， 以及可供研究的人类卵母细胞的稀缺性。而对于精子细胞体外成熟过程，未见有报道。

3 应用及展望

3.1 提高动物繁殖力，促进育种进程

配子体外发生技术的研究，不仅有助于了解卵子发生的调控机制，调控卵子发生，而且有助于提高哺乳动物以及其他动物的繁殖力[41]，大大提高动物生产效率。通过优良畜禽体外的配子发生，可以产生大量的配子细胞，与体外受精，胚胎移植等技术相结合，快速产生大量优良后代，加快育种进程。同时，该技术对野生动物的驯化具有重要意义。在自然界中有大量的物种可供人类使用，但经人类驯化成功并大量利用生产的只有几种。很多物种在驯化的初期圈养过程中会出现生殖障碍的现象，从而使该物种难以驯化甚至不能驯化。利用此技术可以加快特种动物驯化驯养进程，人类可利用的种质资源将大大增加。

3.2 医学上用于治疗不孕不育

可以使用皮肤细胞诱导分化形成性母细胞，以代替自然状态下卵巢或睾丸的功能产生配子。也可以将多功能胚胎干细胞导入到损伤、无法生成配子的睾丸或卵巢中，使之功能重现，从而实现不孕不育的治疗[24,42]。如果该技术可以适应人类细胞的必要的安全性要求，它将绕过女性生育能力的主要限制因素，即卵母细胞的数量和质量[43]。作为一种治疗不孕的方法，该方法可以帮助年轻妇女卵巢功能不全、接受体外受精的不孕妇女、因癌症治疗而导致生育能力受损的癌症幸存者和绝经后妇女。这种治疗策略已经应用于原发性的卵巢功能不全的患者，并且产生了健康的胎儿[44-45]。而对于睾丸功能受损的男性，也具有良好的治疗效果，通过SCF、BMP4、LIF等多种物质的合理组合，高效地实现精原干细胞地诱导，成功治疗不育小鼠并产下健康后代[46]。

3.3 与转基因技术相结合

转基因技术在很多动物中有所限制，例如禽类的转基因，由于操作早期胚胎的困难，仍然非常低效。无论是逆转录病毒法，还是显微注射法，甚至是早期胚胎细胞培养法转基因的传递效率都非常低。调整技术次序，重构其配子发生可克服这种技术障碍[47]。可以通过皮肤细胞等具有诱导多功能干细胞潜力的细胞体外培养，并通过逆转录病毒侵染转基因。然后再诱导去分化、再分化生成PGCs，体外配子发生或将PGCs移植到睾丸或卵巢中完成了整个配子发生过程。

3.4 推动生殖生物学的发展

成功的体外配子发生为人类生殖细胞发育的各个方面提供非常有价值的信息，包括转录控制、表观遗传重编程、减数分裂和基因组稳定性的机制[48]。这些知识反过来有助于辨别异常生殖细胞发育疾病，包括不孕不育，发育受损，生殖生理障碍，以及多种的遗传或表观遗传的疾病[49]，促进早期疾病胚胎的筛选。