任凯旋 夏育民

19世纪中期，电疗法逐渐开始应用于医学治疗中。随着技术的不断进步，等离子体以其独特的疗效被广泛应用于外科手术治疗。等离子体最早用于电外科手术治疗，通过热效应使细胞脱水、蛋白变性及组织坏死等原理对组织进行切割、凝固及术中小血管止血。近年来常压低温等离子体受到广泛研究,因其安全性高、离子活性强等优点，在皮肤、肿瘤、耳鼻喉及口腔领域拥有广泛的应用前景[1]。与目前手术中常用的高温等离子体不同，低温等离子体主要应用于杀菌、助基因转染、细胞分离及促伤口愈合等方面。近年来研究发现，CAP能够调节细胞活性、增殖、迁移、炎症反应[2]；并以ROS/RNS 作为介质影响细胞分化、凋亡、细胞结构(如细胞骨架及结缔组织)的完整性[3]；抑制肿瘤细胞生长并促进肿瘤细胞凋亡的作用[4]。现有研究表明CAP能够调节角质形成细胞的生物学效应，然而CAP的产生机制、具体成分、功能及其作用机理尚不完全清楚，各研究之间没有明确的统一界定标准，难以比较。因此本文就CAP对皮肤角质形成细胞的生物学效应及作用机制进行综述。

1 CAP发生机制

CAP的发生机制为基于电介质阻挡放电、以射频电容耦合的方式在正常大气压下产生等离子体，其主要成分为电子、离子、光子、原子、分子、活性自由基及射线等。与高温平衡等离子体(>80℃)不同,CAP为非平衡等离子体,其特殊的物理性质使其温度维持在20℃～40℃，其机制为等离子体中电子升温速度快于其他粒子，而CAP中含有大量质量较大的离子、分子等，虽然局部电子温度升高但等离子体整体仍保持低温水平。从发生装置将CAP分为直接等离子体源、间接等离子体源及混合等离子体源。直接等离子体源以人体作为一端电极，电介质阻挡放电即为此类等离子体源，其直接采用空气进行激发产生等离子体，并直接作用于处理对象表面；间接等离子体源为由两个电极产生等离子体后通过喷射装置传输到处理部位，如等离子针、等离子炬等；混合等离子体源综合了前两种等离子体源的发生方式，如阻挡电晕放电MiniFlatPlaSter为此类等离子体发生装置。从激发气体所产生的等离子体成分可分为空气、氩气、氦气及氮气与氧气的混合气体；以作用于处理对象的方式不同可分为两类，直接等离子体及间接等离子体，直接等离子体指等离子体流直接接触处理对象，间接等离子体指等离子体使用等离子体处理后的媒介作用于研究对象发挥效应，如等离子水(PAW)及等离子体处理过的培养基等。

2 CAP治疗皮肤疾病

2.1 慢性难愈合伤口 CAP在体外实验中具有高效的抗原核生物和生物膜作用，在体内实验中对慢性难愈合伤口也有抗感染作用。Wende等发现CAP作用后伤口细菌负荷量明显少于未处理组，且伤口愈合程度也明显优于未处理组[5]。体外实验中CAP能减少慢性伤口细菌负荷、无任何副作用，而且在处理严重伤口时其促进伤口愈合能力明显强于安慰剂组。CAP能够激活角质形成细胞通过旁分泌作用释放血管生成因子作用于血管内皮细胞促进血管生成，同时增加局部ROS/RNS浓度使血液灌注到损伤部位[6]。目前临床研究已证实CAP处理慢性难愈合伤口2～5 min/d可显著降低伤口的细菌负荷并促进伤口愈合，MicroPlaSter多用于此类慢性难愈合伤口治疗[7]。

2.2 皮肤肿瘤 CAP对肿瘤细胞的作用有剂量依赖性，而且其抗肿瘤效果与肿瘤细胞的生长速度成反比。氧化应激与人皮肤肿瘤的发生发展有着密切连系，与角质形成细胞相关的皮肤肿瘤有基底细胞癌与鳞状细胞癌两种。长期紫外线暴露导致的细胞抗氧化能力减弱可能与皮肤癌症的发生有关。目前皮肤肿瘤方面的研究多为CAP对恶性黑素瘤的治疗，Binenbaum等用冷等离子体射流处理黑素瘤细胞及裸鼠种植瘤，体外实验中CAP处理黑素瘤细胞60 s后，细胞增殖明显抑制；体内实验中，CAP处理可抑制黑素瘤细胞侵入表皮层[8]，提示临床可应用CAP抑制黑素瘤的恶性侵袭性发展。

2.3 银屑病 在银屑病模型的体外实验中，CAP处理后细胞线粒体功能障碍且溶酶体渗出增加，IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、VEGF及其mRNA表达量均升高，IL-12表达量降低。已知银屑病患者体内IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α高于正常水平，且VEGF是银屑病发生发展过程中炎症和血管生成的关键因子。IL-12水平与银屑病临床症状相关，活化的T细胞通过IL-12和IL-23来放大炎症反应，因此临床上常以IL-12作为治疗银屑病的靶点，同时CAP中的UVB临床上常用于银屑病皮损治疗[9]。Klebes等在银屑病皮损的临床研究中采用疗法为CAP处理1 min/cm2，每周5次共持续2周，75%患者2周后PASI评分降低，且红斑及渗出均减少，提示CAP有望成为银屑病的治疗新方法[10]。

除以上几种疾病外，CAP在延缓衰老[11]、黑素瘤[12]及异位性皮炎[13]的治疗中也有着广泛的应用前景。

3 CAP对角质形成细胞的作用

3.1 CAP影响细胞周期 目前认为CAP对细胞周期的调节主要是通过DNA氧化损伤造成，氧化损伤的DNA单链易在碱不稳定位点断裂导致DNA双链解链，并与可能已经存在的DNA断裂片段形成彗星尾。与UVB导致的DNA损伤不同，CAP处理HaCaT细胞后立刻出现彗星尾结构，处理后4 h内开始降低且在24 h内恢复正常。与UVB照射组相比，细胞内DNA 24 h甚至48 h后DNA损伤仍未能修复，提示UVB导致的DNA损伤不可逆，而CAP处理可激活细胞DNA修复机制，同时达到阻滞细胞周期的效应[14]。CAP处理后的细胞呈剂量依赖性地阻滞在G2/M期，ROS导致的DNA结构损伤被ATM/ATR感知，ATM/ATR激活CHk1/2，导致细胞周期依赖性激酶25阻滞细胞有丝分裂。ATM/ATR也可以通过激活肿瘤抑制蛋白p53诱导细胞凋亡。CAP产生的H2O2作用于G1和G2/M细胞周期检查点导致细胞周期停滞于G2/M期[15]。CAP处理后p53表达增加、PARP分解，但细胞周期停滞蛋白p21及其mRNA表达含量明显升高，提示等离子体可通过直接调节基因表达来调控细胞周期[11]。

有研究发现CAP使细胞周期停滞于G2/M检查点以促使肿瘤细胞凋亡，主要是通过降低细胞周期蛋白B1及细胞周期蛋白依赖性激酶1，上调p53、细胞周期蛋白激酶抑制因子1(p21),升高Bax(Bcl-2-like protein 4)/Bcl-2比值来介导细胞周期停滞导致肿瘤细胞凋亡[16]。CAP可降低癌细胞的迁移能力和细胞活性，研究表明CAP对细胞周期内处于各期的细胞均有影响，未进行细胞有丝分裂的细胞在CAP作用下多停滞于G0/G1或者S期[17]，CAP处理后S期细胞中组蛋白磷酸化的H2AX(γH2AX)含量明显增多，由于γH2AX是DNA双链断裂的标志，由此证明CAP主要通过氧化损伤DNA来阻滞细胞周期。

3.2 CAP促进细胞因子分泌 CAP能够调控3000多条结构蛋白基因表达以及某些炎症介质的释放，如生长因子和细胞因子等。Zhong等发现CAP处理后人角质形成细胞中IL-12降低，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA表达增多[9]。CAP也能显著诱导角质形成细胞内青蒿琥酯(Artemin)、EGF、内皮素-1(ET-1)、成纤维细胞生长因子(FGF-2)及uPA的表达。CAP刺激角质形成细胞表达TGF-β1和TGF-β2，TGF-β的功能主要有炎症趋化、纤维化、血管生成及诱导自身基因表达的作用[18]。在治疗伤口过程中，CAP能够激活角质形成细胞分泌伤口愈合相关分子促进伤口愈合，且通过旁分泌作用释放血管生成因子作用于血管内皮细胞促进血管生成。

3.3 CAP调节细胞黏附相关蛋白 CAP可通过下调缝隙连接蛋白Cx43(gap junctional protein connexin 43)、钙黏蛋白E(E-cadherin)、整合蛋白(integrins)来调节细胞间及细胞与基质间的黏附作用。

Cx43分布于角质形成细胞外表面，高表达的Cx43使细胞间连接密切从而抑制细胞迁移和伤口愈合。CAP处理后角质形成细胞中Cx43 mRNA和蛋白的表达均显著降低，提示CAP可能通过降低角质形成细胞表面的Cx43调节细胞迁移能力，促进伤口愈合[3]。等离子体处理后1 h和24 h后角质形成细胞中Cx43 mRNA和蛋白的表达均显著降低，提示Cx43的表达降低可能与细胞迁移能力提高有关。提示CAP可能通过降低角质形成细胞表面的Cx43调节细胞迁移能力，促进难愈合伤口愈合。

钙黏蛋白E是细胞间紧密连接结构的主要连接蛋白，CAP处理细胞60 s后，细胞内钙黏蛋白E表达量显著降低。表皮生长因子样蛋白3(CELR3)与细胞信号转导和细胞黏附功能有关，并且在表皮细胞间、表皮与间叶组织之间起信息传递的作用，CELR3独特的功能使其可能成为CAP作用的靶蛋白从而调节细胞迁移及生长修复[19]。

CAP还可通过臭氧和过氧化氢调节整合素表达。人角质形成细胞膜主要表达整合素α2和整合素β1，研究发现CAP可以上调细胞膜表面整合素α2表达，当CAP处理时间为5 min时整合素α2、整合素β1、整合素α5、整合素α6、整合素β3均表达增多。慢性难愈合伤口细胞中角质形成细胞表达整合素α5减少导致整合素α5β1受体表达下调，提示CAP可以通过增加伤口部位角质形成细胞内整合素α5的表达促进伤口愈合[20]。

3.4 CAP调节细胞抗氧化相关酶及蛋白 核因子E2相关因子2(NRF2)控制着许多抗氧化通路，CAP处理后人角质形成细胞中NRF2与还原性谷胱甘肽均表达下降。NRF2在编码抗氧化蛋白、解毒酶的合成及调节内环境氧化还原水平中起到重要的调节作用，谷胱甘肽代谢是NRF2相关信号通路的标志性事件。NRF2能够感知氧化应激反应并启动抗氧化程序从而维持细胞内环境稳定。在基础状态下，KEAP1保护NRF2不被泛素降解。当细胞内半胱氨酸发生氧化反应时，NRF2从KEAP1上解离，并与细胞核内抗氧化反应相关基因的启动子结合从而启动转录表达，该基因编码ROS解毒酶、抗氧化物等蛋白质如谷胱甘肽转移酶、细胞色素P450、NQO1酶(NADPH-quinone oxidoreductase 1)、血红素加氧酶1(HMOX1)、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCLC)、谷氨酰半胱氨酸连接酶调节物(GCLM)、超氧化物歧化酶1-3(SOD1-3)、硫氧还蛋白(TRX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)及非酶类抗氧化物如谷胱甘肽等。BACH1通过其亮氨酸拉链与抗氧化相关基因结合从而抑制基因转录，虽然CAP对BACH1表达的影响机制并未明确，但是BACH1能够抑制NRF2介导的血红素加氧酶1的表达下调[21]。总之，CAP主要通过诱导细胞抗氧化作用，通过NRF2/KEAP1信号通路调节细胞抗氧化反应。

3.5 细胞凋亡相关分子 CAP对细胞的凋亡效应主要通过RONS对细胞的形态、能量代谢相关酶及凋亡相关细胞因子的调节发挥生物学效应。CAP处理后细胞内RONS含量升高，许多分子量为42～45KDa的肌动蛋白被氧化，研究表明肌动蛋白的氧化修饰会导致细胞骨架改变并诱导细胞凋亡，从而导致细胞形态的改变。CAP处理后，顺乌头酸酶和α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)均丧失活性，细胞能量供应受到影响从而促进细胞凋亡[4]。线粒体在细胞凋亡过程中起调节作用，CAP作用下多个细胞内外信号导致线粒体内氧化应激作用累积，使线粒体内氧化物更易穿透线粒体膜进入胞浆，并促进促凋亡因子如细胞色素C释放，该过程主要由Bcl-2蛋白家族调控并启动酶联反应[22]。CAP作用使细胞培养基和缓冲液中NO产物如亚硝酸盐和亚硝基硫醇含量增加，由于亚硝酸盐和亚硝基硫醇在UVA或蓝光的作用下不依赖酶也可以生成NO，因此CAP作用下细胞内NO浓度升高，而NO可通过升高cGMP的浓度调节细胞因子的表达，从而介导细胞凋亡。

3.6 其他相关分子 CAP促进角质形成细胞β防御素表达[23]。防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子蛋白，在皮肤炎症状态及皮肤损伤部位均能够发现防御素的表达，其主要功能类似抗菌肽(AMPs)，通过结合在细菌细胞膜上造成膜穿孔，使细胞内重要离子和营养物质外流，从而破坏细菌细胞完整性，起到抵抗细菌、病毒及真菌感染的作用。

4 CAP的安全性研究

有学者对CAP的致突变效应进行研究，CAP处理角质形成细胞2 min后孵育观察72 h，未见明显毒性反应发生。连续处理过程中，每24 h CAP处理1～2 min连续处理4次，仍未产生细胞毒性反应。但处理5 min时细胞活力明显下降，间隔24 h重复处理后并未发现损伤累积作用。与UVC对照组相比，CAP导致的基因突变并不显著，接近于随机突变水平[24]。Lademann等对CAP的温度及其发射的紫外线进行了研究，发现CAP中紫外线剂量并不足以在人皮肤表面引起红斑效应，而且处理部位未发现CAP导致的热损伤[25]。因此认为CAP应用于体外培养的细胞尚无基因毒性作用，但CAP的体内作用机制及其副作用仍需进一步研究。

激发气体种类不同CAP中RONS成分也不尽相同，目前认为以氮气为激发气体产生的CAP较以空气为激发气体的CAP对细胞的损伤作用更小，安全性更好，添加氮气后CAP中RNS的含量增多，而添加氧气后ROS显著增多。潮湿环境下等离子体中ROS更产生且高浓度的ROS如H2O2易造成组织损伤，75% O2与25% N2混合气体作为激发气体时ROS和RNS含量均达到最低且基因表达和蛋白质水平最高。当100% N2或75% N2和25% O2混合气体作为激发气体时，产生的ROS和RNS最多，对细胞及组织的损伤作用最强[26]。而目前氩气作为最常用的激发气体，其优点如下: (1)在临床可获得;(2)化学反应惰性，激发后产生有毒物质少；(3)相较其他气体如空气更容易激发。因此相较于氮气、空气及其他混合气体成分而言，氩气作为惰性气体激发后产生的有毒物质少，常温常压条件下更易被激发，产生的CAP温度更低从而保证其对组织的热损伤效应亦最小，因此目前认为最安全的CAP为氩气来源。

5 结论

综上所述，低温等离子体以其独特的生物学特性拥有广泛的临床应用前景。目前尽管有学者提出了数条可能的信号通路，如GP-PKG信号通路、RhoA-ROCK、Nod2-NF-kB信号通路[22]及NRF2/KEAP1信号通路[20]，但确切的CAP蛋白质靶点仍未明确，CAP的作用机制仍需进一步研究。由于多种因素均能影响CAP的生物学效应，如处理时间长度、气体来源、气体流速和激发电压及培养基的成分、体内外实验差异等，使不同研究结果之间难以进行比较。因此，随着CAP生物学效应研究的不断深入，建立标准化的实验体系亦系迫在眉睫。