胡平 王艳 许争峰

(南京医科大学附属妇产医院、南京市妇幼保健院 产前诊断中心，江苏 南京 210004)

我国出生缺陷发生率约为5.6%[1]，很大一部分是由染色体畸变所引起，主要包括染色体数目异常、大片段异常和染色体微缺失微重复。染色体畸变涉及多个基因，可引起多种组织和器官发育异常，绝大部分症状严重，且无有效治疗手段，受累终生，危害严重，产前诊断是现阶段预防染色体畸变的最重要手段。

有别于常规的出生后遗传病诊断，产前诊断有着明显的特点和困难。首先，由于在宫内，胎儿症状无法进行直接观察，也不能获得更多的辅助检查信息，导致很多重要的临床信息丢失；其次，胎儿发育异常或者畸形有着很强的遗传异质性，同一种表型可能涉及几十种染色体综合征；另外，很多染色体综合征临床表型有着不同的表现度或外显率，往往同一种综合征在胎儿期有着很大的表型差异，尤其是有些微缺失/微重复在胎儿时期临床表征一般较少较轻、线索很少，很容易漏诊。因此，高效、理想的产前遗传学诊断技术应包含以下技术特征：高分辨率、快速、全基因组检测，可同时检测基因组剂量变化和染色体结构变异。

核型和染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技术现已成为了产前诊断的一线技术。核型作为染色体畸变的金标准已使用多年，可检测大的结构变异和染色体数量变化，但是其分辨率低，小于5～10M就无法检测，费时费力，通量难以提升，且存在一定的培养失败风险。相比于核型分析，CMA技术具有快速、准确、精准、客观、通量高的优势，可以检测出染色体数目异常、大片段异常、微缺失微重复、单亲二倍体(uniparental disomy，UPD)、三倍体等，但是无法检测结构变异。两者联合应用可以基本覆盖所有的染色体畸变以及结构异常，满足产前遗传学诊断的需求，大大提升了检测的阳性率。其他的检测技术如FISH、MLPA、QF-PCR、BOBs等，逐渐成为了辅助补充手段，在特定情况下使用。

高通量测序技术的出现为染色体畸变以及拷贝数变异(copy number variation，CNV)检测提供了新的手段。2009年BMCBioinformatics首次报道了一种名叫拷贝数变异测序(copy number variation sequencing，CNV-seq)的技术，可以在全基因组范围内检测CNV。CNV-seq对DNA进行全基因组低深度高通量测序，采用短序列比对分析和counts计算统计来检出CNV；该技术与芯片有着完全不同的原理，一个是基于DNA分子杂交信号计算，一个是基于比对counts的计算统计，但均可以实现CNV的检测。该技术的出现为CNV的检测提供了一种新的方案，且和芯片一样具有快速、方便、准确的优势，丰富了CNV检测的技术方法。

CNV-seq技术首先被用于果蝇的染色体CNV检测以及肿瘤基因组的检测[2，3]，后续被逐渐用于人类遗传病相关CNV检测。2013年Hayes JL[4]报道了对39例儿童样本进行了aCGH芯片(8×60K, BlueGnome)和CNV-seq检测的比较分析，CNV-seq对11例阳性均检出，与芯片有着很好的一致性。2014年Liang D[5]采用SNP-array和CNV-seq对72例(62例儿童和10例流产样本)样本进行染色体综合征的检测比较分析，发现SNP-array和CNV-seq的一致性为100%。2015年Liu S[6]对64例流产物采用CNV-seq与核型进行了平行比对，CNV-seq除了1例三倍体无法检测漏检，其他非整倍体检出完全一致，还意外发现了一个核型漏检的22q11.2微缺失。2015年Cohen K[7]采用CNV-seq技术对aCGH(BlueGnome)检测失败的9例产前诊断样本进行分析，准确地发现了致病性CNV，证明了CNV-seq对于DNA质量不好的样本也可以有效检测。这些小规模的研究提示CNV-seq技术对于染色体畸变检测具有应用潜力。

后续开展了一些更大规模的产前诊断临床应用评估研究。2016年许争峰团队[8]报道了CNV-seq(low-pass sequencing)对多种样本类型共计570例的大样本检测分析，包括流产、死产、羊水、脐带血、外周血，检出的阳性样本均得到了验证。2016年Zhu XY[9]采用CNV-seq和SNP-array(Affymetrix CYTOSCAN HD)芯片对115例先天性心脏病胎儿样本进行比对分析，发现两者均检出21例染色体畸变，一致性为100%。2018年报道[10]采用CNV-seq进行大规模的临床前瞻性研究，在3398例超声检查正常和软指标异常的产前诊断样本中，发现3%(112例)异常，所有染色体异常均得到验证，相比于核型可以增加0.97%的阳性检出率。2018年Wang J[11]开展了3429例产前诊断样本前瞻性研究，分为3类样本：高龄、高风险、超声软指标，检出的致病性染色体异常均得到了验证，CMA与CNV-seq有着良好的一致性，作者提出CNV-seq可作为产前诊断的一线检测手段。

这些研究证实了CNV-seq是一种染色体畸变分析的可行手段，可检测全基因组范围内的包括染色体非整倍体、大片段异常、微缺失微重复，为CNV的检测提供了一种快速方便的新型技术手段，CNV-seq对于染色体畸变的检测准确性与芯片相当。此外，与芯片相比，CNV-seq存在以下优势：①对于DNA样本的兼容性高和需求量更小，最低仅需要10～50ng基因组DNA，远低于芯片的200ng。临床实践中部分的新鲜羊水DNA样本量确实较少，且DNA完整性欠佳，不能达到芯片的上样质控要求，而CNV-seq可以克服这些缺点，适合羊水等产前样本。②随着测序技术的广泛应用，测序成本不断下降，CNV-seq在价格方面有着明显的优势，价格比芯片便宜很多，降低了该技术的应用门槛，让更多的患者得到此项技术服务。③近几年高通量测序技术已经得到了大量推广和普及，CNV-seq所需要的测序仪是可以与其他项目如NIPT共用，可以一机多用，避免了额外购买昂贵的染色体芯片专用设备，因此CNV-seq技术的普及和推广也更容易。作为一种新型的技术，CNV-seq很大程度上解决了很多机构对于CNV的检测问题，引起了业内的广泛关注，2019年邬玲倩等发表了CNV-seq产前诊断的专家共识，对该技术的临床应用进行了规范，对于该技术以后的应用推广起到了良好的促进作用。

值得注意的是，现阶段CNV-seq技术在产前诊断中应用仍要注意以下问题：①相比于核型与CMA，CNV-seq无法检测UPD、多倍体和结构变异，会导致漏诊，建议采用QF-PCR结合CNV-seq可以同时检测出多倍体。②相比于芯片，芯片探针的位点设置和选择是有偏向性的，在致病基因区域设置的探针更密更多，CNV-seq由于是全基因组随机测序，测序位点没有偏向，测序覆盖的均一性更好，也可以检测出更多的CNV。因此，会增加更多的VOUS，尽管有助于新基因的发现，但是在临床中也额外增加了分析解读和临床咨询的工作量。③市场上主流的芯片，其探针位点往往多是经过大量样本的多轮测试和挑选，已经是一个标准化的产品，成熟稳定可靠，每款的检测效能是非常明确的。CNV-seq技术在产品标准化方面仍然需要加强提升，不同的测序仪器、测序体系、测序深度、测序方案以及分析计算算法[12]，都会影响着结果的准确性和一致性，尤其是CNV断点的判断准确性是否可靠，有时候这对于产前诊断CNV分析十分重要。④迄今为止，CNV-seq在临床应用的文献报道仍然不多，仅仅十余篇，而在产前诊断中的应用研究更少，集中在我国几个实验室，对于CNV-seq在产前诊断中的全面评估，现有数据显然是不够的。仍然需要更多的研究数据支撑，尤其缺乏一些与核型或者CMA的平行比较研究和多中心联合评估研究，特别是评估CNV-seq对病理性CNV的检测灵敏度、特异性、适应证等，需要更为明确的数据，为遗传咨询和产前诊断提供精确和全面的信息。

随着分子检测技术的发展和遗传诊断要求的不断提高，整合CNV和结构变异(structural variation，SV)是大势所趋。染色体SV是芯片技术无法克服的困难，但已有文献报道测序技术可以解决这个问题，CNV-seq技术如果能整合检测SV的功能，克服芯片的这个缺陷，将CNV和SV检测结合在一个体系中完成，提高检测效率、节省检测成本、节约时间，或许可以替代现有的核型和芯片检测技术，显著提升出生缺陷遗传病的防控水平。