朱 丽, 贡子琦, 张雨婷, 陈书玲, 程 宏

(1. 江苏省苏州市中西医结合医院, 江苏 苏州, 215101; 2. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225001)

子宫肌瘤(UL)也称子宫平滑肌瘤，好发于30～50岁育龄期女性，是女性生殖系统最常见的良性肿瘤[1-3]。目前的研究[4-6]表明，子宫肌瘤的发病因素涉及遗传因素、生长因子及其受体过度表达、细胞凋亡与增殖改变、类固醇激素及其受体表达异常增高以及一些其他因素。细胞凋亡是一种体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而引起的细胞死亡过程[7-8]。细胞凋亡的特点是细胞沿着自身存在的程序结束其生命的主动死亡过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡，这和因外界因素导致的炎症反应进而引起的细胞坏死有着本质的区别[9-10]。

子宫肌瘤中出现的平滑肌细胞增殖过度，一方面可能是由于细胞增殖力加强，另一方面也可能是由于细胞凋亡而受到了抑制[11]。虽然细胞凋亡与细胞增殖完全不同，细胞凋亡也不能影响细胞增殖的能力，但细胞凋亡若受到抑制，就可使更多的细胞处于存活状态，从而增加细胞的数量，也就间接地促进细胞增殖。既往有关子宫肌瘤与细胞凋亡的研究多集中于B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA水平，存在一定的局限性。本研究将重点放在蛋白质水平，通过对比患者子宫肌瘤组织与正常组织中Bcl-2和Bax的蛋白表达水平、Bcl-2/Bax比值及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和Caspase-9的活化状态，分析细胞凋亡抑制在子宫肌瘤发病机制中的作用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年10月—2016年10月苏州市中西医结合医院妇产科因子宫肌瘤而行子宫切除的住院患者20 例，年龄35～56岁，平均(45.00±5.45)岁。所有患者术前3个月未使用过类固醇类激素，术后即从肌瘤瘤体及瘤体旁正常平滑肌组织中取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm组织各1块，称重后置于液氮中保存备用。子宫切除后，标本经常规病理检查确诊为子宫平滑肌瘤。子宫肌瘤组织设为研究组，同源正常子宫平滑肌组织为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA片段化分析[12]: 从液氮中取出子宫肌瘤瘤体及瘤体旁正常平滑肌组织，加入细胞裂解液(100.0 mmol/L Tris pH值8.0, 200.0 mmol/L NaCl, 10.0 mmol/L EDTA, 10.0 mg/mL SDS, 200.0 ng/mL RNase A), 37 ℃孵育1 h, 加入蛋白酶K至终浓度为300.0 ng/mL, 50 ℃温育3 h; 采用等体积酚/氯仿和氯仿抽提后，取上清，加入1/10 体积3.0 mol/L乙酸钠及2倍体积的无水乙醇以沉淀DNA, 采用70%乙醇洗涤DNA, 室温干燥，加入TE, 取少量进行15%琼脂糖凝胶电泳，恒压2 V/cm。

1.2.2 蛋白样本制备[13]: 从液氮中取出组织，反复研磨成粉状，加入磁珠及裂解液(碧云天生物技术公司)，手工匀浆5～8 min, 将组织匀浆液以12 000 转/min、4 ℃下离心15 min, 离心后液体分3层，提取中间无色液相，置于-80 ℃长期保存或置于-20 ℃短时间保存。

1.2.3 蛋白浓度测定[14]: 本实验采用改良Lowry′s法测定蛋白浓度(碧云天生物技术公司)。

1.2.4 Western Blot测定凋亡相关蛋白的表达[15]: 以2.5 g/L为标准，配置20.0 L蛋白上样液, 100 ℃沸水中煮5 min; 制备聚丙烯酰胺凝胶，上样后电泳; 将蛋白转移至PVDF膜; 将PVDF膜置于封闭液中室温封闭2 h; 一抗4 ℃孵育过夜: 抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体、抗P53抗体、抗活化型Caspase-3抗体及抗β-actin抗体等，抗体购自美国SIGMA公司及武汉博士德公司; 洗膜后二抗室温孵育1 h; 再次洗膜后电化学发光(ECL)显影并观察实验结果。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 子宫肌瘤瘤体及瘤体旁正常平滑肌组织

DNA片段分析

提取子宫肌瘤及瘤体旁正常平滑肌组织的DNA并做DNA片段化分析后发现，瘤体旁正常平滑肌组织中的染色体DNA出现断裂，有明显DNA ladder产生，而同时检测的子宫肌瘤组织的DNA则未见明显DNA ladder(图1)。进一步检测发现，研究组(子宫肌瘤瘤体)有5例出现DNA断裂的梯形条带(25%)，而对照组有15例出现200 bp左右阶梯条带(75%), 并且从断裂条带数量上看，研究组DNA碎片少于对照组。

a: 子宫肌瘤瘤体;b: 子宫肌瘤瘤体旁正常平滑肌组织

图1子宫肌瘤瘤体及瘤体旁正常平滑肌组织DNA片段化检测结果

2.2 凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达分析

Bcl-2是Bcl-2家族中主要起抑制细胞凋亡的成员，而Bax则是Bcl-2家族中主要起促进细胞凋亡的成员，它们的表达量增加或减少与凋亡有密切关联，尤其Bcl-2/Bax比值更能反映细胞凋亡的程度。与对照组相比，研究组中Bax的表达明显较少，而Bcl-2的表达则明显较高。见图2。进一步检测所有样本(n=20)的Bcl-2及Bax的表达，并由此计算Bcl-2/Bax比值，结果显示研究组较对照组Bcl-2表达明显增加，而较对照组Bax表达则明显减少，研究组较对照组Bcl-2/Bax比值显著增加(P<0.05)。见表1。由此可见，子宫肌瘤发生、发展过程中细胞凋亡的减少与Bcl-2及Bax的表达有关，尤其与Bcl-2/Bax比值有明显关系。

a: 子宫肌瘤瘤体;b: 子宫肌瘤瘤体旁正常平滑肌组织;β-actin为内对照
图2子宫肌瘤瘤体及瘤体旁正常平滑肌组织Bcl-2及Bax表达检测结果

表1 研究组与对照组Bcl-2、Bax表达及Bcl-2/Bax比值

Bcl-2表达指Western Blot检测结果中Bcl-2/β-actin的灰度值;Bax表达指Western Blot检测结果中Bax/β-actin的灰度值;与对照组相比, *P<0.05。

2.3 凋亡相关蛋白Caspase-3及Caspase-9的活化情况分析

与对照组相比，研究组中Caspase-3的活化明显较少，活化的Caspase-3片段P17和P10仅有极少量; 同时，检测Caspase-9的活化情况显示，对照组中有非常明显的Caspase-9活化片段P35出现，而研究组中虽有Caspase-9活化片段P35, 但量明显不如对照组。见图3。由此可见，子宫肌瘤发生、发展过程中减少了细胞凋亡，而且这一抑制细胞凋亡过程与抑制Caspase-3和Caspase-9活化有关。

a: 子宫肌瘤瘤体;b: 子宫肌瘤瘤体旁正常平滑肌组织;β-actin为内对照

图3子宫肌瘤瘤体及瘤体旁正常平滑肌组织Caspase-3和Caspase-9活化检测结果

3 讨 论

细胞凋亡是一种细胞主动自我杀伤的过程，这一过程需要特定基因及酶的参加。细胞凋亡早期就出现了核的改变，此时DNA断裂并形成的200 bp片段及其整数倍的梯形条带(每个核小体上缠绕的DNA长度即为200 bp), 这也成为细胞凋亡的特征性变化[16]。本研究采用了DNA片段分析来判断细胞凋亡的发生，结果显示瘤旁正常子宫肌组织出现凋亡较多，有明显的DNA梯形条带，而子宫肌瘤组织中出现凋亡则较少，且正常子宫肌组织DNA碎片明显多于子宫肌瘤组织。本研究结果表明，与瘤旁正常子宫肌细胞相比，子宫肌瘤组织中的细胞凋亡明显减少，细胞凋亡受到了抑制，进一步说明子宫肌瘤的发生、发展可能借助细胞凋亡抑制来实现。

在体内，只有调节好细胞增殖与细胞凋亡的相互平衡才能维持机体正常的生理功能和细胞的状态、数量，否则可能通过多种方式诱导肿瘤的发生。恶性肿瘤的发生往往与细胞凋亡有着密切的关联。本研究中，除了检测DNA ladder以外，还专门设定了与细胞凋亡相关的基因表达产物的检测。有研究[17]发现在子宫肌瘤组织中凋亡抑制基因产物Bcl-2明显高于周围正常肌组织，但其主要通过研究mRNA水平或者免疫组化，缺乏蛋白定量或半定量水平的研究。本研究采用Western Blot的研究方法来分析Bcl-2、Bax的表达水平及Bcl-2/Bax比值，探讨Bcl-2家族在子宫肌瘤发生机制中是否起到作用。

Bcl-2基因家族是一个大的基因家族，既包括抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Ced-9等基因，也包括促进凋亡的Bax、Bcl-xs、Bad、Bak等成员。细胞中高表达Bcl-2可使细胞减少或消除凋亡，有延长细胞寿命的作用，被称为“长寿基因”。研究发现，子宫肌瘤组织中出现Bcl-2基因发生突变而导致过度表达，从而抑制了子宫肌瘤细胞的凋亡，并使细胞生存的时间加长，导致了细胞堆积，并最终促使子宫肌瘤形成和发展。Bax最主要生物学功能是促进细胞凋亡，具有抑制肿瘤、减少肿瘤发生的作用。在体内 Bcl-2与Bax蛋白以异二聚体形式结合来发挥作用，若体内有很多Bcl-2蛋白同二聚体形成就会抑制细胞凋亡，而形成Bax蛋白同二聚体则会促进细胞凋亡。当Bcl-2与Bax蛋白形成异二聚体时，Bax就可以发挥抑制Bcl-2抗凋亡的功能[18]。因此，Bcl-2与Bax蛋白在细胞内的比例是细胞凋亡的重要调节因素。本研究采用Western Blot的方法，从蛋白水平证明了子宫肌瘤瘤体的细胞凋亡抑制与Bcl-2较高表达及Bax较低表达有关，表明子宫肌瘤的发生可能与Bcl-2家族成员有关，且进一步说明Bcl-2/Bax是一个很有价值的指标，可以很好地分析细胞凋亡发生的情况。

Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，与凋亡的发生密切相关。从功能来看, Caspase可分为两类，一类是起始Caspase，另一类是执行Caspase。起始Caspase受到信号转导通路的影响被切割而得到激活，活化后的起始Caspase对执行Caspase进行切割并使之得到激活，被激活的执行Caspase通过对其靶蛋白的水解，导致细胞凋亡的发生。Caspase-9是一种起始Caspase，而Caspase-3是一种目细胞凋亡执行Caspase。黎清等[19]研究发现，相比于正常子宫平滑肌组织, Caspase-3在子宫肌瘤组织中的表达明显减少，说明子宫肌瘤的发生可能与Caspase-3表达的减少有关。本研究进一步分析了Caspase-3和Caspase-9的活化，结果表明伴随子宫肌瘤组织细胞凋亡的减少, Caspase-3和Caspase-9的活化减少，而由于Caspase-3的低表达或活化减少，导致细胞凋亡不能更多的启动，也就促使子宫平滑肌细胞出现凋亡障碍，因而不能及时清除异常细胞，最终抑制细胞凋亡发生而造成细胞数量增加。由此可见，子宫肌瘤发生过程中出现的细胞凋亡抑制可能涉及对Caspase活化的抑制，尤其是抑制了Caspase-9这一起始Caspase，表明子宫肌瘤的发生、发展很可能与抑制细胞凋亡的内源性途径有关。

综上所述，子宫肌瘤的发生与细胞凋亡异常，尤其是细胞凋亡过度抑制有关，而且这一细胞凋亡抑制过程可能与Bcl-2/Bax升高有关，与抑制Caspase活化有关，并与抑制内源性细胞凋亡有关。