陈恕之

(1. 扬州大学, 江苏 扬州, 225000;2. 江苏省南京鼓楼医院集团仪征医院 肿瘤科, 江苏 仪征, 211900)

胃癌是中国常见的一种恶性肿瘤, 2017年中国国家癌症中心报告胃癌发病率在男性中排第2位，女性中排第4位，其病死率在男女患者中均居第2位。胃癌不良预后与多种因素有关，研究[1-3]表明胃癌确诊时年龄、术前血清乳酸脱氢酶(LDH)、术后肿瘤TNM分期、组织分级、Lauren分型等临床病理因素与预后关系密切，存在于肿瘤组织中的肿瘤干细胞(CSC)与肿瘤的发生、侵袭、转移、耐药以及复发密切相关[4]。CD44分子是一类细胞表面跨膜糖蛋白，是最重要的透明质酸受体，是肿瘤干细胞的重要标记之一[5]。CD44可以通过激活信号传导及转录因子3(STAT3)提高细胞周期数蛋白Cyclin D1的表达[6], 刺激胃癌肿瘤干细胞增殖。Cyclin D1过度表达将导致不可调节的失控性细胞生长和肿瘤发展。目前, CD44和Cyclin D1的表达状态与胃腺癌临床病理学特征关系的研究尚少。本研究采用免疫组化方法检测104例胃腺癌根治术后患者的CD44和Cyclin D1的表达状态，并分析其与胃腺癌临床病理学特征的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究资料

选取本院2014年2月—2018年2月收治的Ⅰ～Ⅲ期胃腺癌根治术后患者115例，剔除切缘阳性、资料不全及手术前新辅助化疗病例11例，共纳入有效病例104例，逐一调查并记录患者一般情况(包括性别、年龄)，手术前乳酸脱氢酶(LDH)水平，手术记录包括胃切除范围(全胃/部分胃切除)，术后病理按照美国癌症联合委员会(AJCC)第7版胃癌分期整理，包括癌细胞组织学分级、浸润深度(T分期)、淋巴结转移情况(N分期)、Lauren分型。所有入选患者的手术组织标本经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋，每个胃癌标本4 μm连续贴邻切片共5张，分别行抗Cyclin D1、抗CD44免疫组化染色。采用EnVision两步法进行免疫组织化学染色实验操作。兔抗人单克隆抗体CD44、鼠抗人单克隆抗体Cyclin D1及IHC染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 结果判定方法

抗体阳性的判定标准为在背景清晰的情况下，特定部位呈均匀的棕黄色颗粒状着色, CD44定位于细胞膜, Cyclin D1定位于细胞核。结果判断标准参照Fromowitz阳性细胞半定量分级法，结合染色强度和范围进行判定。随机观察5个高倍视野(10×40), 每个视野计数100个细胞，先根据阳性细胞所占百分数计分(<5%为0分, 5%～<26%为1分, 26%～<51%为2分, 51%～75%为3分, >75%为4分)，再根据阳性细胞染色强度计分(无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分)，然后根据两者相加所得总分进行结果判定，所有病例的IHC染色结果按照评分设为2组，即低表达组(0～3分)和高表达组(4～7分)。见图1。

A. Cyclin D1高表达

B. Cyclin D1低表达

C. CD44高表达

D. CD44低表达

图1免疫组化法检测胃癌组织CD44和CyclinD1的表达状态(10×40)

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 患者基线特征

本研究入选104例患者，按照Cyclin D1和CD44表达状态分别分为低表达组和高表达组, Cyclin D1低表达组62例(占59.6%), 高表达组42例(占40.4%), CD44低表达组48例(占46.2%), 高表达组56例(占53.8%)。经比较基线特征数据，不同CyclinD1和CD44表达状态的患者构成比或均数情况如下: 年龄(采用Mann-WhitneyU检验，检验水准α=0.05)、性别、肿瘤位置差异均无统计学意义(P>0.05), 术前血清乳酸脱氢酶(LDH)、T分期、N分期、Lauren分型、组织学分级参数差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。Cyclin D1和CD44表达状态的关系见表2。LDH数据分布经过Shapiro-Wilk检验符合正态分布(P>0.05), 年龄分布不符合正态分布(P<0.05)。

2.2 Cyclin D1和CD44表达状态与临床病理学参数相关分析

104例患者基线特征显示: 患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤切除范围、淋巴结清扫范围在Cyclin D1、CD44的不同表达状态组分布均衡; 患者术前LDH水平、术后病理T分期和N分期、Lauren分型、肿瘤组织分级在不同Cyclin D1、CD44表达状态组分布不均衡，差异有统计学意义(P<0.05)。横向比较CyclinD1和CD44不同表达状态下，上述构成比有差异的各临床病理学参数所占比例发现: Cyclin D1和CD44高表达组术前乳酸脱氢酶平均水平均高于低表达组; Cyclin D1和CD44高表达组肿瘤T分期T1、T2期病例占比低于低表达组，而T3、T4期病例占比高于低表达组; Cyclin D1和CD44高表达组N分期N1、N2期病例数占比低于低表达组, N3、N4期病例占比高于低表达组; 而Cyclin D1和CD44高表达组Lauren分型肠型病例占比低于低表达组，弥漫型和混合型病例数比例高于低表达组; 同样Cyclin D1和CD44高表达组，组织学分级为1级的病例占比低于低表达组，而组织学分级为2级、3级的病例占比高于低表达组。纵向对比在上述各临床病理学参数类目中，不同Cyclin D1和CD44表达状态所占比例发现: 随着肿瘤浸润深度逐渐加深(T1→T4), Cyclin D1和CD44低表达组病例占比有逐渐降低的趋势，而Cyclin D1和CD44高表达组则相反; 随着淋巴结转移数目增多(N0→N3), Cyclin D1和CD44低表达组病例占比有逐渐降低的趋势，而高表达组则相反; 从Lauren分型类别中，预后良好的肠型在Cyclin D1和CD44低表达组病例占比高于低表达组，而预后较差的弥漫型则相反; 在组织学分级类别中，随着肿瘤组织细胞分化程度的变差(1级→3级)，Cyclin D1和CD44低表达组病例占比有逐渐降低的趋势，而Cyclin D1和CD44高表达组则相反。上述所对比的临床病理学参数在Cyclin D1和CD44不同表达组的差异有统计学意义(P<0.05)。Cyclin D1和CD44表达状态相同(同时高表达或同时低表达)的病例数比例远高于Cyclin D1和CD44表达状态不同(一个高表达，另一个低表达)的病例数比例，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明Cyclin D1和CD44的表达状态与以下临床病理学参数有关: 术前LDH水平、T分期、N分期、组织学分级、Lauren分型。Cyclin D1的表达和CD44的表达之间具有联系。

采用Spearman检验法和Kendall′s tau-b检验法行秩相关性检验，结果显示: Cyclin D1、CD44的不同表达状态分别与术前LDH水平、T分期、N分期、组织学分级、Lauren分型行相关性检测，相关系数均介于0.2与0.4之间(P<0.05), 提示低度正相关。Cyclin D1和CD44的表达状态之间相关性检测相关系数r=0.736,P<0.001, 相关系数显著性概率水平为0.01, 表明Cyclin D1和CD44的表达状态呈现高度正相关。决定系数R2=0.541 7。Cyclin D1、CD44的不同表达状态分别与性别、年龄、肿瘤位置、胃切除范围、淋巴结清扫范围无显著相关性。见表3。

表1 构成比有统计学差异的临床病理学参数列表

LDH: 乳酸脱氢酶。P值采用Pearson卡方检验，百分比数据以当前例数占总例数的比例计算。

表2 Cyclin D1和CD44表达状态的关系[n(%)]

百分比数据以当前例数占总例数的比例计算,Fisher精确检验P<0.001。

3 讨 论

Cyclin D1和CD44在胃腺癌中有较高的表达率。本研究探讨可切除胃腺癌根治术后，组织标本Cyclin D1和CD44的表达与临床病理学特点的关系，结果显示胃腺癌中Cyclin D1高表达的比例为40.4%(介于Hanaa M Ibrahim等[1]报道的50.0%和Casasola等[7]报道的29.2%之间), CD44的高表达比例为53.8%(介于Fatma Senel等[8]报道的45.0%和黄名威等[9]报道的62.4%之间)。推测造成不同研究之间Cyclin D1和CD44高表达的比例差异的原因，可能与各个实验试剂所采用抗体不同等因素有关。

表3 CyclinD1和CD44表达状态与临床病理学特征线性相关分析

LDH: 乳酸脱氢酶; LN清扫: 淋巴结清扫范围。

*相关系数的显著性概率水平α为0.01(双侧);**为Spearman检验法，其余检验方法为Kendall′s tau-b检验。

本研究患者的临床病理学基线特征反映出, Cyclin D1和CD44的表达强度和术前LDH、T分期、N分期、Lauren分型、组织学分级等临床病理学参数相关，说明Cyclin D1和CD44的表达影响了肿瘤细胞的生物学行为，并导致了上述临床病理学参数的变化。Cyclin D1和CD44高表达导致了术前LDH升高、肿瘤浸润深度较深、淋巴结转移数目较多、Lauren分型呈现弥漫型、组织学分级差等不良预后的临床病理学特征。此前有研究[1、10-11]认为Cyclin Dl的表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移程度及TNM分期密切相关，与性别及组织类型无关，也有研究[12-13]认为Cyclin Dl的表达与淋巴结转移程度、TNM分期、胃癌细胞分化程度等无关。同样有资料显示, CD44的表达与肿瘤分化程度[14]、组织学类型[15]、TNM分期[16]、Lauren分型[17]等有关。但也有不同研究结果，如Cao等[18]研究认为CD44表达与TNM分期无显著相关，Arici等[19]认为 CD44过表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及脉管侵犯无关。本研究证实了CD44和Cyclin D1的表达状态不仅分别与术前LDH水平、术后肿瘤T分期、N分期、组织学分级、Lauren分型等临床病理学参数呈正相关，而且相关性检测系数提示均为微弱相关(相关系数r介于0.2～0.4), 同时也明确了CD44表达与Cyclin D1的表达呈正相关，而且相关性检测系数为强相关(相关系数r为0.763)。

分析CD44与CyclinD1的表达状态分别与上述临床病理学参数呈弱相关的原因，可能与以下因素有关: ⑴ Cyclin D1和CD44的表达在影响肿瘤细胞生物学行为的同时，其本身的表达也受多种复杂调控机制的影响。① CD44表达受到多重调控。研究[20]表明，抑癌基因p53可在转录水平上抑制CD44的表达; 而原癌基因Ras作用相反，可以促进CD44表达[21]。其他肿瘤转移、侵袭相关因素均可影响CD44表达, TIMP1可以上调B细胞表面CD44表达水平[22]; 间质指标TWIST1[23]等也可正调控CD44表达; 而上皮指标E钙黏蛋白参与对CD44的负调控[24]。此外，非编码RNA也可调控CD44表达, miR-34[25]、miR-373[26]、miR-199a[27], miR-328[28]均可以通过结合CD44 mRNA 3′-UTR抑制CD44表达。② Cyclin D1是细胞增殖周期中的启动因子，是G1期细胞增殖信号的中枢和限速事件，其表达活性在多个水平上被精确调控，Cyclin D1活化受细胞周期蛋白调节亚基激活，细胞周期蛋白/CDK复合体磷酸化和去磷酸化等因素调控，另外, CDK蛋白抑制剂家族如P21cip1、P27kip1、P57kip2能够抑制Cyclin D1活化; P16ink4A、P18ink4C、P19ink4D等能够特异性抑制细胞周期蛋白D/CDK4和细胞周期蛋白D/CDK6(CDK4/6)的活化，从而抑制Cyclin D1活化。而上述调控因子的合成、降解和活化均受到细胞内在和外在检测点的调控。有研究[29]发现, 性别决定域Y-box2(SOX2)表达可以下调Cyclin D1表达。⑵ 胃腺癌的临床病理学参数除了与Cyclin D1和CD44表达相关外，还与其他多种因素的相关。如Her-2基因扩增[30]、C-C趋化因子22(C-C motif chemokine 22)[31]、miR-10b、miR-21、miR-143、miR-145的表达[32]等。在上述多重因素共同复杂作用下, Cyclin D1和CD44的表达对上述临床病理学参数的作用受到相互牵制、削弱与影响，因此表现为弱相关。Cyclin D1和CD44表达强相关，决定系数R2=0.541 7, 说明Cyclin D1和CD44能相互解释对方54.17%的变异。推测CD44-STAT3-细胞周期蛋白D/CDK4和细胞周期蛋白D/CDK6 (CDK4/6)-Cyclin D1信号传导途径可能在胃癌发生发展与转移中起到重要作用。

本研究结果显示, Cyclin D1、CD44在胃腺癌中有比较高的表达率, Cyclin D1、CD44的表达状态与胃腺癌不良预后因素包括术前LDH水平、术后肿瘤T分期、N分期、组织学分级、Lauren分型正相关, Cyclin D1表达和CD44表达高度正相关。本研究同时将胃腺癌细胞Cyclin D1和CD44的表达与常见的胃腺癌不良预后相关临床病理学特征的关系进行分析，阐明两者关系，可引导进一步研究Cyclin D1和CD44在胃癌发生、发展、转移过程所起的作用以及Cyclin D1和CD44对胃癌无进展生存及总生存时间等预后的预测作用，并且有可能为开发胃癌治疗新的靶点药物提供新思路。