王俊江，周天羽，张扬，刘明欣

（辽宁中医药大学附属医院肛肠科，沈阳 110032）

结肠癌组织中miR-98的表达及作用机制

王俊江，周天羽，张扬，刘明欣

（辽宁中医药大学附属医院肛肠科，沈阳 110032）

目的探讨结肠癌组织中miR-98的表达及作用机制。方法搜集40例结肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织标本，实时 PCR检测miR-98在组织中的表达。在HCT116细胞中分别过表达/沉默miR-98后，MTT实验观察miR-98对其增殖的影响；流式细胞技术分析miR-98对细胞周期的影响；Hochest 33258染色判断miR-98对其凋亡的影响。结果实时 PCR检测发现，与癌旁组织比较，miR-98在肿瘤中低表达 （P= 0.022） ；生存分析发现miR-98表达低的患者5年生存率较低 （P＜ 0.05） 。MTT检测发现miR-98可以抑制细胞增殖。miR-98过表达可以抑制细胞周期进程，促进HCT116细胞凋亡。结论 miR-98可抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡。miR-98表达与结肠癌患者的生存期密切相关。

miR-98； 结肠癌； 增殖； 凋亡； 生存期

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，随着医疗水平的进步，结肠癌治疗取得了很大的进展，但复发率始终居高不下，Ⅲ～Ⅳ期大肠癌患者的5年生存率较低［1-3］。因此，结肠癌的早期诊断和特异性治疗尤为重要。

microRNA （miRNAs） 是一组非编码RNA。miRNAs参与多种生理活动和病理进程。很多miRNAs在结肠癌中异常表达，miR-31和miR-182在结肠癌中低表达，对结肠癌细胞的生长迁移有一定的抑制作用［4］。在SW480细胞中过表达miR-143或miR-145可以促进细胞程序化死亡［5］。结肠癌细胞中过表达miR-126可以降低细胞的增殖率［4］。所有研究均提示miRNAs可能成为结肠癌治疗的潜在靶点［6］。实验研究［7］表明miR-98在结肠癌中可以调节Warburg效应，抑制乳酸生成，但是具体机制尚不清楚。

本研究分析40例结肠癌患者癌组织标本miR-98表达情况，MTT实验和Hochest 33258染色判断miR-98对HCT116细胞增殖、凋亡的影响，旨在探讨结肠癌组织中miR-98的表达及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

选取辽宁中医药大学附属医院2010年至2015年40例术前未接受过放化疗的结肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织，组织取下后置于-180 ℃液氮中备用。其中＜60岁7例，≥60岁33例；TNM分期Ⅰ期7例、Ⅱ期25例、Ⅲ期8例。其他材料包括HCT116细胞（实验室冻存） ，DMEM培养基 （美国HyClone公司） ，胎牛血清 （天津灏洋公司） ，四甲基偶氮唑蓝、MTT、DMSO （上海碧云天公司） ，Trizol、异丙醇、氯仿 （上海生工公司） 。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养HCT116细胞，置37 ℃5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 MTT实验：将处于对数生长期的细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板中，细胞培养12 h后分别转染miR-98 mimic或miR-98 inhibitor （广州锐博生物公司） ，每组每个时间点设3个复孔。转染后分别在0，12，24，36，48 h添加MTT （5 mg/mL） 10 μ L，孵育4 h，弃去培养基，使用100 μ L DMSO溶解MTT-甲臜结晶，15 min后在490 nm处记录吸光度（optical density，OD）值。

1.2.3 Hochest 33258染色：将处于对数生长期的细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板中，细胞培养12 h后分别转染miR-98 mimic或miR-98 inhibitor，每组设3个复孔。转染24 h后分别添加PBS洗3次后，Hochest 33258染色20 min，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察。

1.2.4 实时 PCR检测：1 mL Trizol裂解组织后，加0.2 mL氯仿，振摇15 s，室温静置2～3 min。离心15 min。吸取上层水相，加入0.5 mL异丙醇，混匀。离心10 min弃上清。加入75 %乙醇，振摇。离心5 min干燥后，用DEPC处理水溶解沉淀，55～60 ℃孵育10～15 min。所用引物为miR-98，F，5’-ACACTCCCUAUACAACUUA C-3’；R，5’-GGGAAAGUAGUGAGGCCTCAG-3’；U6，F，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；R，5’-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.5 细胞周期分析：将对数生长期的细胞制成1×106/L浓度的细胞悬液接种于6孔板中，贴壁培养24 h后，加入不同处理因素。作用24 h后收集细胞，PBS洗涤后胰酶消化，制成单细胞悬液。70%的冰乙醇4 ℃固定1 h，PI染液避光染色30 min，流式细胞仪测定细胞周期。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，OD值比较采用非配对 t 检验；40例肠癌组织与相应癌旁组织比较采用非配对 t 检验，利用对数秩检验理论对数据进行生存分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-98在结肠癌中的表达

实时 PCR结果显示，结肠癌组织与癌旁组织中miR-98的含量分别为 （1.064±0.052）和（0.645±0.039），癌组织中表达明显低于癌旁组织，差异有统计学意义 （P= 0.022） 。miR-98的表达与患者的生存期密切相关，miR-98高表达患者的生存期更长，见图1。

图1 miR-98与肠癌患者生存期的关系Fig.1 Relationship between miR-98 and survival duration of patients with colon cancer

2.2 miR-98对结肠癌细胞生长的影响

在HCT116细胞中分别过表达或低表达miR-98后，通过MTT实验检测细胞的增殖情况，结果发现转染24 h后可以显著抑制HCT116细胞增殖；miR-98抑制24 h后HCT116细胞增殖开始显著增加，见图2。

在HCT116细胞中分别过表达或低表达miR-98后，通过流式分析技术检测了细胞周期，结果发现miR-98过表达可以抑制G1-S期的转化；miR-98受到抑制后G1向S期进程加快，见表1。

在HCT116细胞中分别过表达或低表达miR-98后，通过Hochest 33258实验检测细胞的凋亡情况，结果发现miR-98过表达可以促进HCT116细胞凋亡；miR-98受到抑制后HCT116细胞凋亡亦受到抑制，见图3。

图2 miR-98对HCT116细胞增殖的影响 （n = 3）Fig.2 Effect of miR-98 on HCT116 cell proliferation （n = 3）

表1 miR-98对HCT116细胞周期的影响 （%）Fig.1 Effect of miR-98 on HCT116 cell cycle （%）

3 讨论

结肠癌发病率以每年超过100万的新增病例迅速增长，在我国也呈现逐年上升的趋势［8］。因此有必要寻找更好的能够诊疗结肠癌的靶点。多种miRNAs在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用［9］。在结肠癌中有多重miRNAs异常表达的现象。miR-34在肠癌中表达降低可以抑制肠癌细胞的生长与迁移；miR-200可能通过调节细胞周期相关蛋白抑制肠癌细胞的增殖［10］。在肠癌患者的血浆中，miR-92、miR-17-3p、miR-29a表达明显上调，切除肿瘤后，它们的含量下降［11］，说明这些miRNA可能会作为肠癌的诊断依据。已经有报道［12］称miR-98可以通过抑制无氧酵解来抑制结肠癌的进展。

图3 miR-98对HCT116细胞凋亡的影响×200Fig.3 Effect of miR-98 on HCT116 cell apoptosis ×200

本研究发现miR-98在结肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织。数据显示miR-98高表达患者的5年生存期较好，这说明miR-98与患者预后密切相关。结肠癌患者的预后与其细胞的增殖及迁移能力密切相关。研究表明miR-98可以抑制HCT116细胞的增殖。细胞周期的进程是调节细胞增殖的关键因素，进一步检测miR-98对细胞周期的调节作用发现，当miR-98过表达时细胞周期G1向S期转化的过程受到阻滞，这说明在一定程度上miR-98是通过对细胞周期阻滞来实现细胞增殖的抑制作用。细胞凋亡也是影响细胞增殖的关键因素，本研究发现miR-98可以促进细胞凋亡。由此可见miR-98不仅与结肠癌的预后相关，也可以抑制结肠癌细胞的增殖。

综上所述，miR-98在肿瘤组织中低表达，miR-98表达可抑制结肠癌细胞增殖、促进结肠癌细胞凋亡。miR-98表达可以抑制结肠癌的发生发展，这为结肠癌的治疗提供了新的方向。

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Expression and Action Mechanism of miR-98 in Colon Cancer Tissues

WANG Junjiang，ZHOU Tianyu，ZHANG Yang，LIU Mingxin
（Department of Anorectal Medicine，The Affiliated Hospital，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo investigate the expression and action mechanism of miR-98 in colon cancer tissues.MethodsTumor tissues and adjacent tissues were collected from 40 patients with colorectal cancer. The expression of miR-98 in tumor tissues and adjacent tissues was detected by real-time PCR. miR-98 was overexpressed or silenced in cells，and the effects on proliferation，cell cycle，and apoptosis were analyzed using MTT，flow cytometry，and Hoechst 33258 assays.ResultsReal-time PCR showed that the expression of miR-98 in tumor tissues was lower than that in adjacent tissues（P= 0.022）. The survival rate of patients with lower miR-98 expression was shorter than that of patients with higher miR-98 expression. The MTT assay showed that miR-98 overexpression inhibited the proliferation of HCT116 cells. Hoechst 33258 staining showed that the overexpression of miR-98 could inhibit the cell cycle and promote the apoptosis of HCT116 cells.ConclusionmiR-98 can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of colon cancer cells. The expression of miR-98 is closely related to the survival of patients with colon cancer.

miR-98； colon cancer； proliferation； apoptosis； survival duration

R730.5

A

0258-4646 （2018） 01-0009-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171220.1425.008.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2018.01.003

国家自然科学基金 （81202688）

王俊江 （1977-） ，男，副主任医师，硕士.

王俊江，E-mail：wyfdhg@163.com

2017-04-19

网络出版时间：2017-12-20 14:25

（编辑 武玉欣）