段玉红 高 泓 苏虹霞

(1 陕西中医药大学附属医院内分泌二科，咸阳，712000; 2 成都中医药大学附属医院科研科，成都，610075)

糖尿病严重威胁人类健康，发病率逐年上升，成为威胁人类健康的慢性疾病之一。中医认为糖尿病的发病机制比较复杂，而且也受自身体质、生活环境、饮食等因素的影响，使其病机十分复杂[1-2]。在糖尿病的分类中，大约95%为2型糖尿病(T2DM)，其为代谢异常综合征。主要由环境因素和遗传因素导致的复杂疾病。面对T2DM及其并发症给患者带来的危害，预防和治疗T2DM成为研究的热点[3]。目前，随着中医药的不断发展，人们对中药的认识和信任，使糖尿病的治疗有了新的突破。大黄、黄连、知母等多种中药及复方都具有降糖作用，而且不良反应少。其降糖机制具有多成分-多靶点-多通路等特点，影响糖代谢、胰岛素分泌、改善临床症状、修复胰岛B细胞等达到降糖效果[4-6]。依据T2DM的发病机制，确立了清热解毒、泄毒、泻火的治疗方法，基于文献及经典方剂选取三黄汤进行研究。

三黄汤由黄连、黄芩、大黄组成，出自《伤寒论》泻心汤方。方中黄连、黄芩、大黄为典型寒性中药，黄连、黄芩具有清热燥湿、泻火解毒之功，两者相须为用，增强清热燥湿之功，共为君药。大黄具有清热泻火、泻下攻积、凉血解毒等功效。黄连、黄芩、大黄共用可清三焦之热，相辅相成。因此本研究选择三黄汤辨治组方思路与降糖、降脂的研究思路相一致。已经有相关报道三黄汤对T2DM有较好的治疗作用[7]，但其发挥作用的主要化学成分及靶点并不明确，所以本研究基于网络药理学平台筛选三黄汤发挥作用的有效化学成分，采用CTD筛选T2DM的靶标基因。通过DAVID 6.8对靶标基因进行分子功能分析，同时通过STRING进行基因相互作用分析，筛选T2DM的关键靶标基因，基于分子对接技术对关键靶标进行验证。并采用Cytoscape 3.5.1软件构建三黄汤成分-关键基因网络模型。明确三黄汤中14种化学成分通过相互协同治疗T2DM。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 三黄汤化学成分 基于中药系统药理学分析平台(TCMSP)在Herb name中进行查找黄连、黄芩、大黄的化学成分[8-9]。基于CTD(http://ctdbase.org/)筛选T2DM的靶标基因。参照Lipinski′s五规则，选择同时满足-2≤ALogP≤5，OB≥50%，DL≥0.18，MW≤500筛选三黄汤有效化学成分。

1.1.2 靶点分子功能 基于DAVID6.8生物信息学数据，该数据库可以对靶标蛋白或基因进行分子功能、生物过程、细胞成分等分析。

1.1.3 基因相互作用 STRING(https://string-db.org/)，将2型糖尿病(Diabetes Mellitus,Type 2)中的30个基因输入到STRING中，对30个基因之间的相关性进行分析。

1.1.4 分子对接 iGEMDOCK操作相对比较简单，而且对接范围比较广，也可以用于金属对接。

1.2 方法

1.2.1 三黄汤化学成分筛选 相关参数设置为口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥50%,类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18，-2≤脂水分配系数(ALogP)≤5分子量(Molecular Weight,MW)≤500。在TCMSP中下载小分子MOL2结构，采用Open Babel-2.4.1构建成三维结构，对其加氢、加电荷。Open Babel为开源软件，一般用来进行多种分子结构文件格式的相互转换，也可以计算结构描述参数。

1.2.2 T2DM的靶点筛选 在Diseases(疾病)中输入2型糖尿病(Diabetes Mellitus,Type 2)或D003924。进行检索，选择参考数(Reference Count)大于等于130作为T2DM靶标基因。靶标基因包括：基因名称(Gene Symbol),基因ID(Gene ID),疾病名称(Disease Name),疾病ID(Disease ID),参考数(Reference Count)相关信息。

1.2.3 潜在靶点分子功能分析及构建分子功能-靶点网络模型 在线打开DAVID Bioinformatics Resources 6.8，将基因ID(Gene ID)输入到基因列表(Gene List)中，相关参数选择为：基因ID(GENE_ID)，List Type(列表类型)：Gene List(基因列表)。最后选择提交列表(Submit List)。同时，基于Cytoscape 3.5.1软件[10]建立分子功能-靶点网络模型。网络包括活性成分、靶点2类节点。若某一靶点为某化合物的潜在作用靶点，则以边(edge)相连。

1.2.4 基因相互作用分析 输入30个基因名称(Gene Symbol)，来源(Organism):人源(Homo sapiens)，进行相互作用分析。

1.2.5 关键靶点分子对接 小分子支持PDB，MOL和MOL2 3种格式。对接后的结果以氢键(H),电荷能(E)和范德瓦尔力(V)等作用统计，并将能量转换成单位kcal/mol[11-13]。将三黄汤和阳性药共15化学成分与关键靶标进行对接。相关参数设置：解的个数(Number of solution)：2，子代(Generation)：70，群体大小(generic evolutionary method)：200。

2 结果

2.1 三黄汤有效化学成分 黄连活性成分5个，大黄活性成分2个，黄芩活性成分7个。见表1。

表1 三黄汤化学成分

2.2 靶标基因 基于CTD数据库查找T2DM的潜在靶点30个。见表2。

表2 T2DM的靶标信息

2.3 潜在靶标分子功能 30个基因进行分子功能富集分析，选择靶标基因显著发挥作用的分子功能(P<0.05)，涉及的主要分子功能:亚铁血红素结合(Heme Binding)，酶结合(Enzyme Binding)，蛋白酶结合(Protease Binding)，转录因子结合(Transcription Factor Binding)，蛋白质结合(Protein Binding)等。即三黄汤治疗T2DM可能主要通过8项分子功能的相关靶标分子发挥治疗作用。采用Cytoscape 3.5.1软件建立分子功能-靶点网络模型，发现NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1 7个基因涉及到4项及4项以上的分子功能。发挥重要作用，为主要靶标基因，将进一步进行分子对接分析。见图1。

2.4 潜在靶标相互作用 30个基因之间的相互作用关系采用STRING软件进行分析，获取衡量网络的拓扑参数。每一个节点代表一个基因，基因名称位于节点右上方，边(edge)表示基因和基因之间的功能性关联，其颜色不同代表不同的作用关系。相关参数为：节点数(Number of Nodes):29，边数(Number of Edges):304，平均节点度(Average Node Degree):21，avg.局部聚类系数(Avg.local Clustering Coefficient):0.873，预期边缘数(Expected Number of Edges):79,PPI富集p值(PPI Enrichment p-value):<1.0e-16。相互作用结果和分子功能分析结果相一致，NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1 7个基因的degree≥15。整个网络以NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1等靶标基因为中心进行相关联，去掉关键基因，整个网络涣散。见图2。

图1 分子功能-靶标作用网络

注：红色节点表示分子功能，蓝色节点表示靶标，黄色节点表示degree≥4的关键靶标

图2 基因相互作用

注：红线：融合的证据；绿线：共同相邻蛋白；蓝线：证据存在；紫色：实验室数据；黄线：文献检索；淡蓝色：相关性联系；黑色：共表达

图3 三黄汤多成分-关键靶点网络模型

注：红色-关键靶标，蓝色-化学成分

2.5 靶标验证 选择T2DM关键靶标(BCL2,PPARG，HMOX1)基因与三黄汤14个有效化学成分进行分子对接。靶标基因的三维结构下载于PDB数据库。分别为BCL2(4MAN)，PPARG(3U9Q)，HMOX1(1N45)。表3列出三黄汤化学成分与关键靶标对接后的数值。评价标准以结合能(affinity)为主，结合能越小越稳定。为了使结果更清晰，构建了化学成分-靶点网络图(图3)，其中13个化学成分与PPAR结合，(R)-Canadine为结合能量最低；4个化学成分与BCL2结合，NEOBAICALEIN为结合能量最低；14个化学成分与HMOX1结合，NEOBAICALEIN为结合能量最低。

3 讨论

T2DM的发病率逐年上升，与肥胖、血脂异常、代谢异常等诸多疾病关系密切。影响人们的身心健康，所以预防和治疗T2DM当今难题[14]。目前，主要采用调节胰岛素、控制血糖等进行治疗，但是往往会出现一些不良反应及并发症[15]。三黄汤(黄连、大黄、黄芩)为临床清热燥湿常用方剂，药理作用广泛，人们对三黄汤药理作用机制研究逐渐深入。而三黄汤对糖尿病的治疗临床上有较好的效果，但是机制不明确，本研究初步筛选T2DM的关键靶标，对其关键靶标进行深入研究。对接结果发现三黄汤中的14个有效化学成分，13个化学成分与PPAR结合，4个化学成分与BCL2结合，14个化学成分与HMOX1结合。因此，三黄汤中14种化学成分通过相互协同治疗T2DM。Bcl2(BCL2,Apoptosis Regulator)是主要的细胞凋亡调控基因。已经有研究表明,与空白对照组比较，模型组(2型糖尿病)大鼠胰腺Bcl2基因表达降低[16]。葡萄糖与胰岛B细胞相互影响，长时间处于高葡萄糖状态，导致B细胞的凋亡，其凋亡与BCL基因家族中的平衡相关；血红素加氧酶1(HMOX1)为降解血红素的限速酶[17-18]。主要在细胞增殖、氧化、凋亡等方面发挥重要作用，已经有报道HMOX1对脂肪细胞的分化有调节作用。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)主要调节脂肪的生成[19]。HMOX1和PPAR-γ相互影响，PPAR-γ的异位表达影响脂肪细胞分化，HMOX1表达不断降低。BCL2,PPARG，HMOX1在2型糖尿病的发生、发展中起到了关键作用。

表3 三黄汤与关键靶标对接结果(kcal/mol)