刘晓芳 薛小娜 王素梅 张 雯 卫 利 王道涵 尹英敏

(1 北京中医药大学第二附属医院东方医院,北京,100078; 2 北京中医药大学第三附属医院,北京,100029)

多发性抽动症(Tourette Syndrome,TS),是一种儿童精神科常见的神经精神障碍性疾病[1]。肢体肌肉、面部肌肉及颈部肌肉或者患儿出现迅速、反复、不规则的抽动,为TS常见的临床特征。TS往往有冲动、强迫、多动、注意力不集中等各种伴随症状[2]。本病在临床缺乏比较有效的治疗,严重影响了患儿的身心健康,目前受到临床医生与社会公众的极大关注[1]。随着研究的进展,目前迫切需求建立模拟小儿TS的动物模型,进行病因、病理机制、药物筛选及药效学等方面的评价研究,为揭示和有效诊治TS提供研究工具。随着中医对TS的研究逐渐增多,目前模型不能很好反映中医“辨证论治”思想精髓的缺点愈加突出。因此,本次实验拟建立TS大鼠模型的同时,建立其中医证型中的肝郁脾虚证,并对其以评价,以便对中医治疗儿童TS有进一步的深入研究。结合既往文献及课题组前期实验,依据中医病因发病学原理,本课题组以亚氨基二丙腈(IDPN)腹腔注射诱导法后,用饮食失节、慢性束缚以及过度疲劳法建立TS肝郁脾虚证大鼠模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 30只3周龄雄性SPF级SD大鼠(于北京维通利华实验动物技术有限公司购买,许可证编号为:SCXK(京)2012-0001),要求其重量在40～60 g。自由摄食饮水,保持相对的温度及湿度,注意环境通风(温度控制在(22±2)℃,湿度控制在50%-70%)。

1.1.2 药物 0.9%氯化钠注射液(北京双鹤药业股份有限公司，批号:0906201w),10 mL每支;亚氨基二丙晴1瓶(美国Sigma-Aldrich，批号:24859071)。

1.1.3 试剂与仪器 D-木糖酶测试分析试剂盒(南京建成生物科技有限公司,生产批号:A035)；人胃泌素酶联免疫分析试剂盒(江莱生物科技有限公司,生产批号:2402503)；精密电子天平(美国双杰兄弟集团有限公司,JJ2000型)；自发活动视频分析系统(上海吉星软件科技有限公司,DB018型)；DigBehv动物行为分析系统(SOFTRON,JLBehv-RRTM)；数码摄录一体机(HDR SR10E型,SONY)；微量振荡器(北京拓普分析仪器有限公司,DEM-3)；酶标仪(Thermo Scientific，Multiskan MK3)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将自由分笼喂养的大鼠分成3组,每组10只,分别标注为肝郁脾虚组、空白组和模型组。让各组大鼠自由饮水及进食失误,以12 h为白昼黑夜节律。将各组大鼠适应性喂养1周后,参照全身用药法[3]及前期课题实验结论[4-7],模型组及中医证型组大鼠腹腔注射300 mg/(kg·d)的IDPN,空白组则在腹腔内注射同等的氯0.9%化钠注射液。各组均注射7 d,1次/d。

1.2.2 给药方法 参考李艳彦等人的方法[8-10],从腹腔注射IDPN之日起,肝郁脾虚组大鼠于每天上午9:00置于束缚盒中限制其活动3 h,下午3:00放于盛有温水桶内迫其游泳10 min左右。连续3周隔日给大鼠喂食。于造模第21天开始,停止上述造模因素,观察其行为变化。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 自主活动次数测定 每周对各组大鼠进行1次自主活动观察,记录大鼠15 min内的自主活动情况。

1.2.3.2 刻板运动观察及评分 于造模后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天进行刻板运动观察及评分。评分时间为2 min,评分标准参照前期研究[2]。

1.2.3.3 中医证型评价 1)外观变化:观察各组大鼠活动活跃度、毛色顺滑、进食量多少及大便次数的变化。2)重量测定:于实验第1天开始,每隔7天测定1次大鼠的重量。3)胃泌素及D-木糖酶定量测定:在实验第28天测定各组大鼠血清的胃泌素及D-木糖酶。在大鼠眼眶球后取1 mL血,加入无菌试管中。室温静置2 h后将其离心,冷冻保存。采用D-木糖酶测试分析试剂盒以及人胃泌素酶联免疫分析试剂盒检测其含量。4)脾脏与胸腺指数:胃泌素及D-木糖酶定量测定后,对各组大鼠解剖,取其脾脏、胸腺。将各组器官分别称重后,根据公式计算各组大鼠的胸腺及脾脏指数

2 结果

2.1 行为学测定 从实验第4天开始,除空白组外,其余组大鼠在受到外界各种刺激后,出现各种特殊行为,如直立、攀爬。实验第8天,除空白组外,其余组大鼠均出现不同程度的头部抽动,同时舔、嗅、活动增多等行为,部分大鼠出现旋转行为。

2.2 自主活动仪检测 空白组大鼠与其余组大鼠比较,自主活动数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与中医证型组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠的自主活动

2.3 刻板运动观察评分 模型组与肝郁脾虚组比较未见明显差异(P>0.05)。除空白组外,其余各组大鼠第28天与第7天比较,其刻板运动有显著性差异(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠刻板运动评分分)

2.4 中医证型测定与评价 肝郁脾虚组大鼠造模后开始出现烦躁易怒的状态。3周后,肝郁脾虚组

表3 各组大鼠体重比较

大鼠逐渐出现活动及饮食减少,情绪低落,体重增加缓慢(P<0.05),大便次数增多,质地较稀的症状。见表3。

2.5 胸腺及脾脏指数测定 肝郁脾虚组以及模型组与空白组比较,其胸腺、脾脏指数差异分别有统计学意义(P<0.05)。肝郁脾虚组大鼠与模型组大鼠之间比,各组指数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠胸腺及脾脏指数比较

2.6 D-木糖浓度测定与胃泌素测定 中医证型组大鼠与其余各组比较,其D-木糖浓度测定与胃泌素测定差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 胃泌素及D-木糖浓度

3 讨论

多年来,本课题组一直致力于小儿TS的临床与基础实验研究。导师王素梅教授认为,小儿TS病机多属土虚木亢,风痰内扰,临证时采用扶土抑木法从肝脾论治,取得一定疗效。课题组利用“名老中医临床诊疗信息采集系统”及名老中医经验智能分析平台,对王素梅教授于2005年10月至2006年5月之间建立的102例TS病历,进行信息结构化、数据分析,结果表明:共757次诊次中,中医辨证分型以肝郁脾虚最多见,共334例次,占44.12%[11-13]。课题组通过文献查阅亦发现,抽动症患者以肝郁脾虚型为最多见。因此,本课题组认为,建立TS肝郁脾虚证动物模型对本病的中医辨证论治有着重大意义。

参照文献及SD大鼠本身的特点,本实验造模方法基于以下考虑:动物在慢性束缚中,其活动被禁,引起情绪受抑,情志不遂,气机不畅,导致肝郁;迫其每日游泳活动10 min,使有劳累感;给予饮食的时而增加与时而缺失类似饥饱失调,两者相加,与中医的饮食劳倦类似,导致脾胃受损。本次实验过程中观察到,肝郁脾虚证的大鼠体重有明显的减轻,其外观表证发生明显的变化。除了出现头部抽动、旋转行为外,大鼠由开始的易怒烦躁转为情绪低落,同时饮食减少,大便由正常转为稀溏;活动渐少,体重增加缓慢,与中医临床中肝郁脾虚证型表现出的症状较接近。

脾脏与胸腺的功能,对动物有重要意义。脾脏与胸腺的各种改变,目前认为是中医脾虚证的病理学依据之一[14-15]。本次实验中,中医证型组动物的脾脏与胸腺指数与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05),与模型组大鼠比较，差异无统计学意义,表明模型组与肝郁脾虚组大鼠均有免疫力的下降。

胃泌素在人体及动物的消化系统中有重要作用。目前有相关文献表明,其水平下降程度与肝郁脾虚证的严重程度有一定的相关性[16]。本实验中统计学有差异性,说明本脾虚证TS模型具有胃蠕动减弱的病理基础。血清D-木糖含量水平的变化可以较客观地反映儿童的消化吸收代谢功能,是一个与机体的小肠吸收功能有正相关性的检测指标。血清D-木糖水平的变化可以客观地反映人体的消化功能[17-19]。从中医角度而言,脾失健运,无法运化水谷精微,使机体无法吸收其精华。表现在生物学糖代谢方面,则会出现D木糖数值降低。本次实验中中医证型组大鼠与其余各组大鼠比较统计学有差异性,说明其具有肠道吸收功能减弱的表现。

SD大鼠腹腔注射IDPN所诱导的TS模型抽动症状稳定,表面效度良好,可维持较长时间[20-22]。结合饮食失节、慢性束缚以及过度疲劳法建立肝郁脾虚证TS大鼠模型,具有儿童TS中医证型中的肝郁脾虚证的相似症状。但根据儿童TS的临床表现,其生物学特性目前存在一定的差距,且本次实验尚缺乏对肝郁症的生物学检查方法和相关指标,我们将在下一步的深入研究中继续探索以弥补本次不足。