温 睿，王乃慧，李引丽，乔建军，代 锋

(1.西北大学 文化遗产学院/文化遗产研究与保护技术教育部重点实验室，陕西 西安 710069;2.榆林市文物保护研究所 文物保护室,榆林 719000)

根据文献记载,我国古代有以酒随葬的葬俗，最早见于《礼记杂记上》,其载:醴者,稻醴也。瓮、甒、筲、衡实见间[1]。在考古发掘中经常发现墓葬中随葬酒器,少数酒器中还保留有液体或固体物质。墓葬在几百上千年的埋葬过程中,会受到地下水、淤土等周边环境的侵扰,因此,酒器中的液体或固体物质是否为酒的残留物需要科学分析方法来鉴定。国内、外学者对酒残留物鉴别进行过一些探索[2-5]。这些研究大都是通过有机酸的检测,结合考古背景来推测容器中的物质为酒残留物的。非挥发性有机酸是酒中重要的成味物质，其本身具有酸味和特殊口味[6]。不同酒类的主体有机酸有差别,有一定鉴别意义。但是,除了酒以外其他物质,包括奶、醋、酱油等液体物质均含有有机酸。虽然这些物质盛放在酒器中的可能性较小,但仍然不能从理论上排除这种可能性，在酒器与普通盛放器皿尚未区分的时代,仅通过有机酸来鉴别酒的残留物则更加缺乏依据。

本文试图通过红外光谱与高效液相色谱结合的方法[7-11],建立起一套先区分、后分析的检测体系,通过本方法对考古出土的样品进行再分析。

本文检测的考古样品来自陕西榆林走马梁汉墓[12]出土的3件青铜器中的液体和固体残留物(液体残留物编号为M2∶6，M11∶2，M11∶5L；固体残留物编号为M11∶5S)。走马梁汉墓位于榆林市榆阳区牛家梁镇的汉代古城滩城址西南1km处的走马梁,属于温带大陆性气候,夏季凉爽冬季严寒,又紧邻毛乌素沙漠。这一环境有利于有机物的保存。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TENSOR27傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司);SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪SPD-20A紫外检测器(日本岛津公司);J&K CHEMICAL C18 WpH反向色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,北京百灵威科技有限公司);PAX固相萃取小柱(30mg/3mL,美国安捷伦公司);Vortex Genius 3旋涡混匀器(德国IKA公司)。

溴化钾(KBr,光谱纯,天津中世沃克公司);草酸(Oxalic acid, 99%，体积分数);酒石酸(L-(+)-Tartaric acid,99%，体积分数);丙酮酸(Pyruvic acid,98%);L-(-)-苹果酸(L-(-)-Malic acid,99%，体积分数);乳酸(L-Lactic acid,85%，体积分数);富马酸(Fumaric acid,99%，体积分数);柠檬酸(Citric acid,99%，体积分数);琥珀酸(Succinic acid,99%，体积分数)(有机酸均购于北京百灵威科技有限公司);甲醇(CH3OH,色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司);磷酸氢二铵((NH4)2HPO4,分析纯,天津市恒兴化学试剂有限公司);磷酸(H3PO4,分析纯,天津市恒兴化学试剂有限公司);乙醇(C2H5OH,色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司);实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.2 标准溶液配制

以草酸0.250mg/mL、酒石酸2.000mg/mL、苹果酸0.300mg/mL、丙酮酸5.000mg/mL、乳酸5.000mg/mL、柠檬酸6.250mg/mL、富马酸0.110mg/mL、琥珀酸10.000mg/mL,配制8种有机酸的标准混合溶液。分别配制成标准混合溶液的0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,2.0%,10.0%,40.0%,100.0%(体积分数)溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤后进行分析。

1.3 样品前处理

131样品红外光谱检测前处理：考虑到残留物均来源于青铜器中,尤其是固体残留物铜绿色的特殊性,为防止高含量碱式碳酸铜影响到含量相对较低的有机物的检测,也为了将结果代入使用现代相关液体建立的判别模型,故仅对液体残留物进行了红外光谱检测。制备干燥溴化钾压片。久置的液体残留物中液体和沉淀已分层,先将其漩涡震荡0.5min,使液体和沉淀混合均匀,然后迅速以移液器移取0.2mL到溴化钾压片上,液体残留物M11∶2和M11∶5各制3片,40℃下干燥20min。

132样品有机酸检测前处理固体:精确称量0.50g干燥的固体残留物,研磨后与1mL超纯水混合,漩涡震荡1min,超声处理30min使其充分溶解,1200r/min离心5min,取上层清液,用0.45μm有机系微孔滤膜过滤,过滤后样品溶液由浅绿变为无色透明,移入进样瓶待测。液体及沉淀:久置的样品中液体和沉淀已分层,先将其漩涡震荡0.5min,混合均匀,移取0.5mL至离心管内,与0.5mL超纯水混合,漩涡震荡1min,超声处理30min,1200r/min离心5min,取上层清液。用0.45μm有机系微孔滤膜过滤,过滤后样品溶液分别由浅绿和浅黄变为无色透明,移入进样瓶待测。

1.4 优化的仪器工作条件

1.4.1 红外光谱参数 波数为400～2 000cm-1;分辨率为4cm-1;扫描次数16次。

1.4.2 色谱条件 色谱柱:C18 WpH反向色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,北京百灵威科技有限公司);柱温30℃;进样量10μL;自动进样;流动相:A相0.01mol/L (NH4)2HPO4-H3PO4缓冲溶液(以H3PO4调节pH值为2.7)B相100%CH3OH,v(A)∶v(B)=98∶2,等度洗脱,流动相使用前经0.22μm微孔滤膜过滤;洗脱时间12min;流速1.0mL/min;检测波长210nm。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的和前处理方式的优化实验

由于文物样品量非常有限,所以使用标准混合溶液来测评不同溶剂和前处理方法对有机酸的提取效果。

方法a:取0.5mL体积分数10%标准混合溶液,加入0.5mL超纯水,震荡使其充分混合,经0.45μm微孔滤膜过滤后进行分析。

方法b:取0.5mL体积分数10%标准混合溶液,加入0.5mL80%(体积分数)的乙醇溶液,震荡使其充分混合,经0.45μm微孔滤膜过滤后进行分析。

方法c:取0.5mL体积分数10%标准混合溶液,加入0.5mL超纯水,震荡使其充分混合,共1mL,向其中滴加一滴体积分数3%的氨水溶液,摇匀,pH约为9，呈弱碱性。PAX小柱活化后(用 2mL 甲醇和 2mL 去二次水依次以自重过柱,流速约 0.5mL/min,使 PAX 小柱活化),立即移取1mL样品于PAX小柱内,以流速0.3mL/min加压过柱,然后依次以2mL去离子水,2mL甲醇淋洗,最后用1mL 5%(体积分数)的甲酸-甲醇溶液洗脱,洗脱液收集,经0.45μm微孔滤膜过滤后进行分析。

图1结果显示,水的提取效果最佳。乙醇提取的总酸峰面积虽然比较高,但是，8个峰无法实现良好分离,还产生了若干杂峰。然而，使用PAX小柱进行前处理,有机酸损失过多,可能由于这些有机酸的平均电离常数Ka较大。当样品体积较大时,固相萃取才能起到富集的效果。鉴于文物样品的体积有限，而且其中有机酸含量低的特点,PAX小柱前处理不宜用于文物样品中的有机酸检测。

图1 3种提取方法的提取结果Fig.1 3 methods of extraction

2.2 方法验证

2.2.1 红外光谱法判别模型 选取了不同液体(第一大类A),包括牛奶、醋、酱油、芝麻油、黄酒;和不同酒液(第二大类B),包括白酒、米酒、啤酒、黄酒、葡萄酒,采集光谱样本,分别提取41个和44个特征谱峰(见附表)。为了消除不同液体化学成分浓度差异影响判别效果,采用归一化法处理,即将上述所选波长的吸光强度与1 645cm-1波数所对应的吸收强度做比值(所有液体样品在1 645cm-1波数处均有红外吸收),得到相对吸光强度。以特征峰的波数为自变量,相对吸光强度作为因变量,作为Fisher判别分析模型的判别指标,建立判别模型,如图2。经过模拟老化的现代酒的残留物红外光谱结果代入模型，可以实现正确判别[13]。

2.2.2 有机酸检测的标准曲线与线性关系 用8种有机酸的梯度浓度和其在210nm下检测的不同强度响应值绘制标准曲线,线性相关系数(R2)为0.990 74～0.999 86,相关性良好,标样回归方程和线性范围见表1。

图 2 第一大类(A)和第二大类(B)的判别模型Fig.2 2 estimating model

编号物质平均保留时间/min线性回归方程相关系数R2定量线性范围/mg·mL-11草酸Oxalic acid, 99%2.85y=8 788 150.819 67x-264.147 540.993 180.000 50～0.250 00 2酒石酸L-(+)-Tartaric acid3.23y=1 307 759.836 07x+964.836 070.996 570.004 00～2.000 00 3丙酮酸Pyruvic acid3.75y=8 873 000.000 00x-63.000 000.996 440.000 60～0.300 00 4苹果酸L-(-)-Malic acid4.18y=589 731.803 28x+646.508 200.995 850.010 00～5.000 00 5乳酸L-Lactic acid5.28y=332 420.655 74x-93.360 660.999 860.010 00～5.000 00 6柠檬酸Citric acid6.47y=766 685.901 64x-339.557 380.997 770.012 50～6.250 00 7富马酸Fumaric acid7.63y=100 485 752.608 05x+2 449.393 440.990 740.000 22～0.110 00 8琥珀酸Succinic acid8.98y=418 926.229 51x-2 255.852 460.996 690.020 00～10.000 00

2.2.3 有机酸检测的精密度实验 对1%(体积分数)有机酸标准混合溶液进行连续5次分析,每次进样记录保留时间和峰面积,并计算相对标准偏差RSD,8种有机酸的RSD值在0.55%～1.31%之间,表明该方法精密度良好。由于样品量有限,不进行重复性测试和回收率实验。

2.3 实际样品分析

2.3.1 样品的红外光谱判别 每个压片平行测量3次,两个样品的光谱样本均呈现良好的重复性。随机选取M11∶2和M11∶5的各1条光谱样品,选择41个特征峰,归一化处理后,作为预测集代入第一大类判别模型,如图3。

图3 第一大类样品预测Fig.3 Samples in No.1 category

2个样品点与酒的质心点最为接近,而与牛奶、醋、芝麻油和酱油的质心点有较远的距离。

图4为随机选取的2条样品光谱谱图与现代黄酒的光谱谱图。在1 390，1 650，1 172cm-13个波数下均有较强吸收,初步判定含有一定量的酸类、酯类或羰基化合物。

图4 样品和黄酒的红外光谱谱图Fig.4 Spectrogram of samples and yellow wine

再随机选取M11∶2和M11∶5各1条光谱样品,选择44个特征峰,归一化处理后,作为预测集代入第二大类判别模型,如图5。2个样品点均落入米酒和黄酒聚集的范围内,与米酒和黄酒的组质心最为接近。

图5 第二大类样品预测Fig.5 Samples in No.2 category

通过红外光谱识别,可以确定两个液体样品是酒类,而且指向中国古代的传统粮食酒。

2.3.2 样品的有机酸检测 采用1.3节前处理方法对样品进行前处理,并在1.4.2节所述的色谱条件下进行HPLC检测。结果表明,在样品中共检测到7种有机酸,琥珀酸未检测到。4个样品在草酸保留时间范围内(±3%)都出现了高峰,超出线性定量范围,故未进行定量计算。3个样品中检测到乳酸,仅1个样品中检测到了酒石酸。样品M11∶5L中检测到的有机酸种类最多,M2∶6其次,说明酒的液态残留物比固态残留物保存有更多的有机酸,而且青铜器有盖的情况更加利于酒残留物的保存。出土酒残留物中有机酸分析结果见表2。

4个样品中仅1个检测到酒石酸。酒石酸是葡萄酒的主体有机酸[9],若样品是葡萄酒残留物,则在乳酸尚能检测到的情况下,酒石酸理应出现而且含量应为最高。所以，走马梁酒残留物原为葡萄酒的概率非常小。这与红外光谱判别的结果相一致。

酒石酸是广泛存在于植物中的一种有机酸。酒石酸的存在,证实了西汉时制作酒曲确实中会添加一些中草药类植物。这与西晋嵇含的《南方草木状》[14]和北魏贾思勰的《齐民要术》中记载的草曲制法相吻合[15]。中草药类植物的加入,具有增加酿酒微生物的营养,抑制杂菌生长,促进微生物生长代谢与驯化的作用,并能产生特殊香味[16]。时至今日,制作黄酒小曲时仍然使用中草药类植物[17]。中草药类植物会向粮食酒中引入少量的酒石酸,此外,传统方法制作的酒曲中除了用于糖化和酒化的优势菌种,也有一部分产酸杂菌,其产物就包括酒石酸。酒石酸化学性质稳定,容易形成酒石酸盐沉淀保留下来,在一定的条件变化下又还原成酒石酸。理论上讲,酒石酸是残留物中最有可能保留下来的物质之一。

3个样品中检测到乳酸,而且含量较其他有机酸更高。乳酸是粮食酒中(包括现代黄酒、米酒)的主体有机酸,粮食酒制作在制备酒母时,曲中的根霉、毛霉作用,能生成乳酸为主的酸,在酒化过程中乳酸杆菌和链球菌作用也能生成乳酸等有机酸[6]。

草酸也是粮食酒中重要的有机酸之一,含量仅次于乳酸[18],在谷物的浸泡,糖化和发酵过程中产生[19],通常以草酸盐的形式存在。JiaJing WANG等人在使用离子色谱法(IC)对米家崖遗址陶器残留物分析时检测到草酸盐的存在[5],认为这是样品陶器与酒的发酵有关的证据之一。McGovern PE也多次在考古残留物分析中检测到草酸及其盐,并作为酒的标记物之一[21-23]。本研究同样检测到了草酸,与前人的成果相合,但草酸作为酒的标记物在判断酿酒主要原料时,指向性逊于酒石酸和乳酸。

样品中检测到的丙酮酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸4种有机酸在现代粮食酒中含量适中,通常低于或接近各自的阈值[8]。其具体含量随厂家而异,比例无规律性关系[9,11,24-25],与走马梁样品的有机酸检测结果相吻合。

表2 有机酸分析结果Tab.2 Analysis results of organic acids in wine residue

3 结 论

本研究通过对牛奶、醋、酱油、芝麻油、酒等各种古代常见食用液体红外光谱的40余个特征峰进行归一化处理,采用Fisher判别模型实现对上述液体(包括老化以后的液体)的初步区分。在初步区分的基础上,通过高效液相色谱进一步对疑似酒残留物样品的有机酸含量进行检测,根据残留物中有机酸的种类和含量可以推测酒的类别及酿酒原料。

采用上述方法对陕西榆林走马梁汉墓出土的残留物进行分析。结果表明,走马梁汉墓出土3件青铜器中的残留物均为酒残留物。这些酒是通过粮食酿造的发酵酒,酿酒的粮食种类目前无法判断,还需进一步研究。汉代经过初期的休养生息,到汉武帝以后社会稳定,经济发展,酿酒业比较兴盛,这在汉墓的画像石和画像砖中均可以得到印证。范晔的《后汉书礼仪志下》载:东园武士执事下明器。筲八盛,容三升……瓮三,容三升……载以木桁,覆以疏布。甒二,容三升,醴一,酒一。载以木桁,覆以功布……卮八……行方酒壶八……瓦酒樽二,容五斗[26]。这表明从《礼记》成书年代至汉代,随葬酒的习俗一直被当作重要礼仪沿用。从现实层面来说,丰富的随葬品象征着富足,避免死者在离世后遭受饥苦。同时,墓前祭祀是丧葬活动的一个重要环节,饮食类随葬品在其中充当“道具”的角色。走马梁汉墓不属于高等级贵族墓葬[12],根据墓葬形制与器物判断,属于汉朝驻守边塞区域的官员。在这些中层官吏的墓葬中发现酒残留物,说明汉代以酒随葬的习俗已经从贵族走向普通官员甚至普通百姓,也从侧面证明了汉代酿酒业的发达。

本文建立的酒残留物的分析方法能有效地适用于考古出土的酒残留物的鉴定和检测,通过对出土酒残留物的系统检测,可以深入研究中国酿酒技术的发展历程及其与社会发展的关系。