杨迷玲 徐宪伟 张果 曲青山 杨金花

郑州人民医院1病理科，2器官移植科（郑州450003）

肾移植是肾功能衰竭患者的有效治疗手段。随着外科技术的发展和新型免疫抑制剂的发现，肾移植受者的短期存活率显著提高，但移植肾的长期存活状况并没有明显改善［1］。慢性移植肾肾损伤（chronic kidney allograft injury，CAI）是影响移植肾长期存活的主要因素。主要表现为移植肾功能进行性减退，最终可导致肾功能衰竭。预防CAI是提高移植肾存活率的主要目标之一。然而，CAI的发生原因和机制尚不清楚，CAI缺乏早期诊断的生物标志物。因此，本研究用ELISA法和免疫组化法分别检测尿可溶性CD163水平和移植肾组织中CD163和SMA的表达情况，进一步分析尿可溶性CD163水平和CD163标记的M2型巨噬细胞与移植肾间质纤维化和患者肾功能的关系。

1 材料与方法

1.1标本来源选取郑州人民医院病理科2014年至2017年病理诊断为慢性移植肾肾损伤的石蜡标本30例，其中男18例，女12例，年龄18～53岁。按Banff 2017年移植肾活检诊断标准慢性移植肾肾损伤间质纤维化分3级：Ⅰ级12例，Ⅱ级10例，Ⅲ级8例，用Masson三色染色评估间质纤维化来选取标本；同时选取10例正常肾组织作为对照，在选取标本时已除外其他已知原因引起的间质纤维化和肾小管萎缩，只选取非特定致病因素引起的间质纤维化和肾小管萎缩，不伴有肾小管炎和动脉内膜炎；在做肾穿刺的当天留取晨尿10 mL，置于尿管中，以2 000 r/min离心10 min，然后吸取上层尿液分装于1.5 mL离心管中并作好标记，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2主要试剂鼠抗人单克隆抗体CD163（克隆号10D6），鼠抗人单克隆抗体SMA（克隆号1A4）购自福州迈新公司；人sCD163ELISA试剂盒购自美国RD公司。

1.3方法

1.3.1ELISA实验开始前从冰箱取出试剂盒，平衡至室温，按照试剂盒说明书配制所需要的稀释液和洗涤液，并提前将冻存的尿液标本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻。实验操作按试剂盒说明书进行。

1.3.2免疫组化所有组织标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，3 μm厚连续切片，然后用免疫组织化学EliVision法染色。免疫组化操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。预处理：CD163采用柠檬酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 6.0）高温高压修复，SMA无需修复。经DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝，脱水，透明，封片。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。

1.4结果判定ELISA结果判读：用全自动酶标仪在450 nm波长读板，获取吸光值（OD值），每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值后即为最后OD值，然后以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标画出标准曲线，并根据OD值计算出样品sCD163浓度。然后样品复孔取平均值。

用Masson三色染色来评估间质纤维化程度，在400倍镜下，每张切片随机选取25个视野，阳性染色面积占整个区域的比值即为纤维化的程度［2］。

免疫组化结果的判读［3］：CD163标记M2型巨噬细胞，胞浆棕黄色判读为阳性，在400倍镜下，每张切片至少连续计数9个高倍视野，再取其平均值，SMA标记活化的肌纤维母细胞，胞浆棕黄色为阳性。阳性区域计算方法：在200倍镜下，每张切片至少计数6个中倍视野的肾皮质区，避开肾小球和大血管。将所选视野用蔡司显微镜进行拍照，再将图片输入Imagepro plus 6.0图像处理软件对图片进行定量检测。

1.5统计学方法应用SPSS 18.0软件进行统计分析。均数用表示，组间比较用方差分析，相关性分析采用Spearman等级相关性分析。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1Masson三色染色评估移植肾间质纤维化的程度按Banff 2017年［4］移植肾活检诊断标准分3级：（1）Ⅰ级：轻度间质纤维化，累及范围＜25%的肾实质；（2）Ⅱ级；中度间质纤维化，累及范围达到26%～50%的肾实质；（3）Ⅲ级：重度间质纤维化，累及范围＞50%的肾实质。

2.2CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平（表1）sCD163在CAI患者尿液中的表达水平显著高于正常人，随着移植肾间质纤维化级别的升高，sCD163表达水平逐渐增加，患者的血Cr和BUN平均值也逐渐升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平Tab.1 Levels of urinary sCD163，serum creatinine and urea nitrogen in patients with CAI and normal subjects ±s

表1 CAI患者及正常人尿sCD163水平、血肌酐和尿素氮水平Tab.1 Levels of urinary sCD163，serum creatinine and urea nitrogen in patients with CAI and normal subjects ±s

纤维化程度正常Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级例数10 12 10 8 sCD163（ng/mL）0.36±0.05 1.53±0.27 3.66±0.85 5.71±1.02血Cr（μmol/L）65.80±3.99 172.75±24.55 266.20±27.99 447.88±48.52 BUN（mmol/L）4.87±0.84 16.78±2.19 28.10±3.07 42.88±4.52

2.3CD163和SMA在移植肾组织和正常肾组织中的表达（表2和图1）CD163标记的M2型巨噬细胞在移植肾组织间质中的数量显著高于正常肾组织，并且随着移植肾间质纤维化程度的加重，M2型巨噬细胞的数量也增多，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各级纤维化的移植肾组织中SMA和CD163的相对表达量Tab.2 Relative expression of SMA and CD163 in kidney allografts ±s

表2 各级纤维化的移植肾组织中SMA和CD163的相对表达量Tab.2 Relative expression of SMA and CD163 in kidney allografts ±s

纤维化程度正常Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级例数10 12 10 8 SMA 2.90±1.19 21.00±2.69 39.00±4.69 63.75±9.22 CD163 2.70±2.05 91.50±25.36 263.10±51.25 394.75±124.61

SMA在移植肾组织间质中的阳性区域面积显著高于正常肾组织，并且随着移植肾间质纤维化级别的升高而增大，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 移植肾组织中Masson三色染色及免疫组化CD163和SMA的表达Fig.1 Masson tricolor staining and immunohistochemical expression of CD163 and SMA in kidney allografts

2.4 尿sCD163与移植肾组织中M2型巨噬细胞的数量和血Cr的相关性（图2）随着移植肾间质纤维化级别的升高，尿sCD163水平逐渐增加，M2型巨噬细胞的数量也逐渐增多，二者呈正相关（r=0.847，P ＜0.001）。尿sCD163水平与血Cr水平呈正相关（r=0.916，P ＜0.001）。

图2 尿sCD163水平与移植肾组织中CD163+的M2型巨噬细胞和血清Cr水平的相关性Fig.2 Correlation between urinary sCD163 levels and CD163 positive M2 macrophages and Serum Cr levels in kidney allografts

2.5 肾组织中CD163+的M2型巨噬细胞与SMA阳性面积和患者血Cr的相关性（图3）随着移植肾间质纤维化级别的升高，SMA阳性区域面积逐渐增大，M2型巨噬细胞的数量也逐渐增多，二者呈正相关（r=0.963，P ＜0.001）。M2巨噬细胞的数量与血Cr水平呈正相关（r=0.937，P＜0.001）。

图3 移植肾组织中CD163+的M2巨噬细胞与间质纤维化程度和血清Cr水平的相关性Fig.3 Correlation between CD163 positive M2 macrophages and interstitial fibrosis and serum Cr levels in kidney allografts

3 讨论

慢性移植肾肾病（CAN）是影响肾移植患者远期效果的主要因素。CAN在组织学上主要表现为间质纤维化和肾小管萎缩，然而这些组织学表现不具有特异性，在多种移植肾肾病中均可见到，比如免疫抑制剂的药物毒性、慢性排斥反应、病毒感染等。2007年发表的新班夫分类，摒弃了CAN一词，代之以更准确的术语“间质纤维化和肾小管萎缩，非特定因素所致”，命名为慢性移植肾肾损伤（CAI）［5］。2017 年的班夫分类重新定义了慢性活动性T细胞介导的排斥反应，强调了间质纤维化和肾小管萎缩区的炎症（i⁃IFTA）的重要性，中度的i⁃IFTA伴中或重度的小管炎即可诊断为慢性活动性T细胞介导的排斥反应，工作组认为i⁃IFTA与移植物的存活率降低有关［4］。本研究在选取标本时已将已知原因引起的间质纤维化和肾小管萎缩排除在外，并且不伴有小管炎和动脉内膜炎。

CD163是一种分子量约为130 kD的单链跨膜糖蛋白，属于富含半胱氨酸的清道夫受体超家族，是血红蛋白-触珠蛋白复合物的清道夫受体，特异性的表达于单核巨噬细胞膜表面，其在体内有两种存在形式：一种是膜结合型，以跨膜大分子的形式存在于巨噬细胞膜上；而另一种是可溶性CD163，存在于血浆或其它组织液内。CD163是M2型巨噬细胞的标记物，在一定的炎症刺激下，通过金属蛋白酶的水解作用从胞膜上脱落，并扩散到炎症组织或以其可溶形式进入循环，发挥抗炎作用［6-8］。

CAI的发病机制还不清楚。巨噬细胞在多种肾疾病中聚集是一种普遍现象，包括炎症性、非炎症性肾疾病和移植肾损伤。巨噬细胞可以被极化成两种不同的表型，即M1和M2。M1型巨噬细胞具有促炎表型，常与组织损伤有关，而M2型巨噬细胞则是替代途径活化的巨噬细胞，被认为是抗炎表型，常与组织修复有关［9-10］。研究表明CD163阳性的M2型巨噬细胞与多种肾脏疾病的慢性损伤有关，比如在糖尿病肾病（DN）中，肾间质浸润的M2型巨噬细胞与肾间质纤维化、肾小管萎缩、DN分级和肾功能损伤有关［11］。有研究用小鼠单侧输尿管梗阻（UUO）模型来研究巨噬细胞与肾纤维化的关系，研究发现肾损伤后募集的巨噬细胞极化为M2型，M2型巨噬细胞可以促进肾纤维化。消除M2型巨噬细胞可特异性地抑制肾纤维化，而消除M1型巨噬细胞则无此作用［2］。本研究结果显示CD163标记的M2型巨噬细胞在移植肾组织间质中的数量显著高于正常肾组织，并且随着移植肾间质纤维化程度的加重，M2巨噬细胞的数量也逐渐增多，与前述研究结果一致。有研究通过小鼠肾移植模型研究显示骨髓源性的M2型巨噬细胞可以转化为SMA阳性的肌成纤维细胞，进一步促进小鼠移植肾纤维化［12］。SMA是肌成纤维细胞特异的标志蛋白，在肾损伤发生时，大量生长因子和细胞因子相互作用，促使肌成纤维细胞大量增殖、活化。急剧增加的肌成纤维细胞致使细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成增加，增加的ECM沉积于肾间质，正常肾组织结构被破坏、肾功能受损，最终发生间质纤维化［13］。本研究发现SMA在移植肾组织中的阳性面积显著高于正常肾组织，而且随着移植肾间质纤维化级别的升高而增大，SMA阳性面积与M2型巨噬细胞的数量具有显著的一致性，并且M2型巨噬细胞主要位于间质纤维化区域。进一步分析显示患者血清Cr的平均值与M2型巨噬细胞的数量具有显著的相关性，随着移植肾组织间质纤维化程度的加重而升高，这表明M2型巨噬细胞聚集可以促进移植肾间质纤维化的发生发展，引起移植肾功能不全。

有研究认为尿sCD163水平与活动性肾血管炎密切相关，尿sCD163是诊断活动性肾血管炎明显优于尿蛋白排泄率的生物标志物［14］。还有研究认为sCD163可能在汉滩病毒感染后急性肾功能衰竭的发生发展中起重要作用［15］。本研究通过ELISA法检测了CAI患者尿sCD163水平，结果发现CAI患者尿sCD163水平显著高于正常人，并且随着移植肾间质纤维化的进展，尿sCD163水平逐渐升高。相关性分析显示尿sCD163水平与移植肾活检组织中CD163阳性的M2型巨噬细胞的数量呈正相关，随着患者血Cr和尿素氮水平的升高，尿sCD163水平和移植肾组织中CD163阳性的M2型巨噬细胞的数量也逐渐升高，这说明尿sCD163水平可作为CAI患者M2型巨噬细胞依赖性的生物标志物。这与ENDO等［16］的研究结果一致，认为狼疮性肾炎患者肾小球中浸润的细胞主要是CD163阳性的M2型巨噬细胞，尿sCD163水平与CD163阳性的M2型巨噬细胞的数量呈正相关，且与狼疮性肾炎的活动度相关。

以往关于M2型巨噬细胞在肾损伤中的作用多集中在原发肾疾病或移植肾动物模型上，在国内罕见关于尿sCD163水平在CAI中的研究。本研究初步探讨了尿sCD163和CD163阳性的M2型巨噬细胞在CAI中的作用，结果显示CD163阳性的M2型巨噬细胞可以促进移植肾间质纤维化的发生，引起肾移植患者的肾功能不全，最终导致肾功能衰竭，尿sCD163水平可作为CAI患者M2型巨噬细胞依赖性的生物标志物。因此，笔者推测在临床肾移植工作中可以定期检测患者尿液中sCD163水平来预测肾移植患者间质纤维化发生的可能性，对临床防止移植肾纤维化有着重要意义。